COLECClON HISTORICA 
SE-5-86 
Diciembre 5, 1986 
' ANAUSIS ULTRAESTRUCTURAL y RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL 
COMPUTARIZADA DE LA MITOSIS EN ' SUSPENSIONES CELULARES 
DE MAIZ (Zea mays) 
Andrea }/iessen 
Mitosis es un proceso de las celulas eucarioticas mediante el cual los 
cromosomas replicados se separan y van a las c.Hulas hijas; es, por 
tanto, una actividad de fundamental importancia en el ciclo celular. 
Muchos cientlficos han tratado de entender este complejo mecanismo y han 
empleado diversos procedimientos y tecnicas para lograrlo. El 
microscopio de luz y el microscopio electrónico de mayor resolución, han 
ayudado al estudio de la mitosis. A pesar de que han sido notables los 
progresos obtenidos, aun quedan muchos interrogantes sin responder. 
I 
Una de las grandes limitaciones en el estudio de la mitosis ha sido la 
perdida de la imágen tridimensional ue la ce lula . Pero la reciente 
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aparición de microcomputadoras, de lenguajes de programación 
relativamente simples, y de digitadores hacen posible en la actualidad la 
visualización y reconstrucción de ultraestructuras celulares en tres 
dimensiones. 
En la presente investigación se estudiaron las fases mitóticas de 
suspensiones celulares de maiz. Se escogió el maiz (Zea mays) por s u 
papel trascendente en genetica vegetal y en las investigaciones de l a 
biologia molecular vegetal. 
La importancia y el inter e s despertados por el cultivo de tej idos, asi 
como el avance logrado en los "'ltimos anos en las técnicas que éste 
emplea, pronostican un gran potencial a esa nueva ciencia para el 
mejoramiento de plantas. 
Las suspensiones celulare s son ideales para el estudio de la división 
celular porque es posible llegar a su sincronización; éste proceso 
permite aumentar considerablemente el n"'mero de celulas en una misma fase 
del ciclo celular. 
Este estudio comprende la combinación de observaciones al microscopio de 
luz y al microscopio electrónico, y la aplicación de novedosas técnicas 
computarizadas para la reconstruccion tridimensional. 
Microscopia de luz 
La suspension celular esta compuesta de agregados celulares de diversos 
tamaños que aumentan de tamaño con la edad. Observarlos al microscopio , 
de luz es dificil debido a la rigida pared c elular y al compactamiento de 
los agregados de estas células. r 
Se hic i eron observaciones de los agregados celul a res desde el momento de 
su transferencia a un medio de cultivo fresco hasta el octavo dia de 
crecimiento, fecha en que rutinariamente se lleva a cabo una nueva 
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transferencia. Las cAlulas varian significativamente durante este 
periodo. Inicialmente son redondeadas y se organizan de modo compacto. Al 
final del periodo de crecimiento o su, alrededor del sexto dia las 
celulas comienzan a aumentar en volumen, los agregados son menos 
compactos, y el citoplasma aparece menos denso. 
El indice mitotico mas alto, 2.79% lo alcanzo la suspension celular al 
segundo dia de crecimiento. Aunque este indice es relativamente bajo, es 
parecido al indicado por otros autores para cultivos celulares semejantes 
de gramineas. Durante el segundo, tercero y cuarto dias, se encontro un 
porcentaje mas alto de profases; en el sexto y octavo dias en cambio, 
la mayoria de la cA lulas mitoticas estaban en telofase. 
Partiendo de los valores de indice mitotico se puede concluir que la fase 
mitotica mas larga es la profase, la siguiente es la telofase, y las mas 
cortas son la metafase y la anafase. 
Sincronizacion 
Para incrementar el numero de cAlulas en mitosis, se inicio un proceso 
que trata de sincronizar la suspension celular. Este proceso se inicio al 
sexto dia de crecimiento cuando la mayor parte de las cAlulas ya habian 
concluido la mitosis. El proceso de s incronizacion consistio en someter 
las cAlulas a dos tratamientos de fria de tres dias, separados por un 
periodo de 48 hora s en que se les adiciono medio fresco y se dejan a 
temperatura ambiente . Se obtuvo un indice mitotico de 5.14 % el segundo 
dia despuAs de la sincronizacion, es decir, 45.6 % mayor que el obtenido 
antes de la sincronizacion. 
Citologia de microscopia de luz 
Las cAlulas en interfase presentan, dentro de un citoplasma densamente 
coloreado, un nucleo redondo con grupos dispersos de cromatina condensada 
y un nuclAolo compacto. En la profase los cromosomas son delgados y 
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largos, y se encuentran en la denominada conformacion "RabI" ,es decir, 
con todos los centr ómeros agrupados en el po l o nuclear. En algunos casos 
es posible diferenciar el cromosoma seis del maiz que es el cromosoma 
organizador del nucleolo p~r estar unido a el. , 
Es evidente la presencia de sincronia localizada ya que frecuentemente se 
encuentran agrupadas dos o mAs celulas en mitosis. 
En la metafase, los cromosomas se congregan en el plano ecuatorial de la 
celula formando lo que se ha llamado la congresión metafAsica. Se 
observó que todos los centrómeros parecen estar localizados en un mismo 
plano y formando un circulo. 
Las celulas en anafase ya indican la conformación "Rabl" puesto que los 
cromosomas hijos migran hacia los extremos orientados de igual forma. 
Microscopia electrónica y reconstrucción tridimensional 
La mayoria de las ce lulas mitóticas se encontraron en la periferia de los 
agregados celulares. No se observaron cambios evidentes a nivel 
citológico entre las suspensiones celulares de maiz sometidas al proceso 
de sincronización y las que no lo fueron. 
Las diferencias observadas en estas celulas de maiz en diferentes 
periodos de crecimiento se hacen tanto mAs evidentes cuanta mayor 
magnificación se emplea. Durante los primeros dias las ce lulas presentan 
un citoplasma cargado de plastidios y ribosomas asi como de grAnulos de 
almidón y de pequenas vacuo las que rodean el nucleo. Las ce lulas de un 
agregado se encuentran comunicadas entre si por medio de · numerosos 
plasmodesmos. 
.¡ 
A medida que las celulas envejecen aumen tan de volumen, pudiendo 
multiplicar varias veces su volumen original. Las vacuolas pequeñas se 
fusionan para formar grandes vacuo las que llegan a ocupar gran parte del 
espacio citoplasmAtico. Las celulas elongadas alcanzan un estado no 
· " 
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morfog~nico en el cual ya no llevan a cabo la 'mitosis. En algunos casos, 
dependiendo de la direccion en que se ha hecho el corte, las c,Húlas 
parecen binucleadas. En realidad, se trata de los llamados núcleos 
, anillados (' looped nuclei') los cuales han perdido su carac teristica 
forma redondeada y presentan prolongaciones en forma de "U" que se 
forman gradualmente. 
Interfase 
La mayoria de las c~lulas observadas estaban en interfase, y la cantidad 
de cromatina condensada (heterocromatina) presente en el núcleo variaba 
según el periodo interfAsico (Gl, S o G2) en que se hallaba la c~lula. 
Por la forma como se encuentra distribuida la heterocromatina, estas 
c~lulas de maiz pertenecen al grupo de los núcleos reticulados o cromo­
nemAticos, al igual que a lá subcategoria de nucleo 'cap'. 
Tanto si la c~lula se halla en interfase como en profase, se observa en 
ella un grupo de heterocromatina unida a un centro fibrilar del nucleolo; 
este grupo es parte del cromosoma seis que es el organizador nucleolar 
del maiz (NOR). Estos centros fibrilares parecen ser los sitios activos 
del nucleolo. Muchas veces el NOR forma una especie de cinturlm, que 
parcialmente rodea al nucleolo. Otros segmentos de cromosomas, 
representados por partes heterocromAticas, tambi~n estAn en contacto con 
la envoltura nuclear, pero no se observo interaccion entre ellos y los 
centros fibrilares . 
Profase 
En la profase temprana la heterocromatina comienza a condensarse. Con la 
ayuda de las reconstrucciones tridimensionales se logra unir la 
informacion que cada corte presenta para poder determinar, por ejemplo, 
que region de cromatina pertenece a determinado cromosoma y como se 
encuentran localizados los cromosomas dentro del núcleo. Al observar el 
total 'de los cortes de una c~lula (en el caso de un núcleo profAsico eran 
S2 cortes) en tres dimensiones, no se logra discernir nada, pues hay 
'. . 
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demasiada información y las estructuras se sobreponen. Tomando grupos de 
cortes, en cambio, la situación es diferente: se logra identificar los 
cromosomas, su posición dentro del n&cleo, la intima relación que existe 
entre los cromosomas y la membrana nuclear, y la superficie del nucl~olo. 
Los cromosomas estAn en contacto con la membrana nuclear por uno de los , 
telómeros. Con grandes magnificaciones se pueden observar los poros 
nucleares con su estructurca anular y el centro granular. 
Cuando se digita unicamente la membrana nuclear con el nucléolo, la 
imagen tridimensional muestra la redondez del n&cleo en profase y la 
interaccion del cromosoma organizador del nucléolo con el nucléolo. 
En la profase tardia, cuando los cromosomas estAn totalmente condensados, 
la membrana nuclear comienza a invaginarse para desintegrarse finalmente 
en fracciones de similar tamaño; enseguida el Area nuclear pierde 
densidad, y grupos de microt&bulos penetran en ella. 
Metafase 
La membrana nuclear ha desaparecido completamente al igual que el 
nucl~olo. Largos tramos de reticulo endoplasmAtico rugoso rodean la 
región que habia sido el Area nuclear. Los cromosomas se ven compactos y 
se pueden diferenciar la s cromAtidas hermanas. 
Los cromosomas se encuentran en el plano ecuatorial de la célula y se 
observan paquetes de microt&bulos unidos a los cinetocoros en mayor 
nUmero de diez. Los cinetocoros estan en en un mismo plano, pero los 
brazos de los cromosomas estAn orientados en todas direcciones formando 
una especie de cilindro en el plano ecuatorial de la célula. Algunos de 
los cromosomas ya han comenzado a separase y a migrar hacia los polos, lo 
cual indica que la metafase y la anafase son casi simultaneas. 
- .... . . 
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La posicibn del cinetocoro permite determinar si un cromosoma es 
metactl!n.trico, submetactl!ntrico, o acroctl!ntrico, respectivamente, lo cual 
es importante para su identificacibn. El total del huso acromatico se 
encuentra rodeado por fibras de reticulo endoplasmatico que lo aislan del 
resto del citoplasma y evitan de esta forma que los organulos interfieran 
con la migracibn de los cromosomas. Se ha demostrado en otras gramineas 
que este reticulo endoplasmatico controla la concentracibn de iones 
libres de Ca++ en el aparato mitbtico, lo cual influye en la regulación 
de la formacibn de microtubulos y por ende en la motilidad de los 
cromosomas. 
Anafase 
La separacibn de los cromosomas hijos se completa y tl!stos migran a los 
casquetes polares opuestos del huso acromatico, guiados por los micro­
tubulos del cinetocoro y manteniendo los brazos cromosomales hacia atraso 
Durante la anafase la zona del huso acromatico comienza a ser invadida 
por gran cantidad de sistemas membranosos, y en la anafase tardia, cuando 
ya todos los cromosomas han migrado a su respectivo casquete polar, lo 
cual sucede rapidamente, organulos tales como las mitocondrias, los 
grAnulos de almidbn, etc., se observan en la regibn ecuatorial de la 
cHula. 
Telofase 
Aparentemente, una vez los . cromosomas han terminado su migracion se 
vuelve a reformar sin demora la membrana nuclear, la cual es similar 
inicialmente a una tira de reticulo endoplasmatico rugoso, del cual 
quizAs se originb. Muchos ribosomas se encuentran asociados con esta 
zona nuclear, que poco a poco recupera su caracteristica forma 
redondeada. Los cromosomas se desconcentran poco a poco, perdiendo su 
aspecto compacto y su densidad electrbnica. Ya no es posible diferenciar 
cromosomas individuales. El nucleo se encuentra rodeado por un gran 
numero de orgAnulos. 
· " ,... . 
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Citocinesis 
El reticulo endoplasmatico tubular y de cis t erna, al igual que numerosos 
plastidios redondeados en su mayoria, que se encuentran en la c~lula 
parecen migrar hacia la region donde se esta formando el fragmoplasto. 
Esta era la region de la placa ecuatorial del huso acromatico, entre los 
nucleos recien formados. Los plastidios y las tiras de reticul o 
endoplasmatico comienzan a fusionarse desde los extremos de la c~lu la 
para formar poco a poco el fragmoplasto que luego constituira la membrana 
y la pared celular de las celulas hijas. 
Una vez este completo el fragmoplasto, las celulas hij as adquieren 
rapidamente l a s caracteristicas de ce lulas en interfase. La mitosis ha 
culminado y se inicia un nuevo ciclo celular.