Année Universitaire 2012-2013 THEME : THÈSE pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences et Technologies des Aliments de l’Université Nangui Abrogoua Spécialité : Microbiologie et Sécurité alimentaire Présentée par TRAORE Sylvain Gnamien Université Nangui Abrogoua République de Côte d’Ivoire Union-Discipline-Travail Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Numéro d’ordre xx Soutenue publiquement Le 23 -07- 2013 RISQUES DE CONTRACTION DES AFFECTIONS A VIBRIO SP. ET A PARAGONIMUS SP. LIES A LA CONSOMMATION DES CRABES ET DES CREVETTES VENDUS SUR LES MARCHES D’ABIDJAN ET DE DABOU Commission d’examen : Président: - Monsieur KOUAME Patrice, Professeur titulaire, UNA Co-directeurs : - Madame KOUSSEMON Marina épse CAMARA, Maître de conférences, UNA - Monsieur Bassirou BONFOH, Maître de Recherches, CSRS Rapporteurs : - Monsieur N’GORAN Kouakou Eliézer, Professeur titulaire, UFHB - Monsieur OUHON Jean, Professeur agrégé de Parasitologie-Mycologie, UFHB Examinateurs - Madame DOGBO Denezon Odette, Maître de conférences, UNA - Madame KACOU Adèle épse N’DOUBA, Professeur titulaire, UFHB Université Nangui Abrogoua UFR des Sciences et Technologies des Aliments THESE DE DOCTORAT Dédicace TRAORE Sylvain Gnamien I DEDICACE THESE DE DOCTORAT Dédicace TRAORE Sylvain Gnamien II Je dédie ce présent document : A L’éternel des armées Créateur du ciel et de la terre, celui qui fait sortir le pain de la terre et l’eau du rocher, par qui tout est possible, à qui je demande de me donner la sagesse de concevoir tout ce qui est juste et bon, la volonté de l’accomplir et la force de le défendre en tout lieu et en toute circonstance. A ma famille A mon père TRAORE Yéouho et à ma mère TOURE Kinaton pour tous les sacrifices consentis pour mon épanouissement spirituel, intellectuel et moral. Je vous aime et vous remercie pour votre patience, vos prières et vos encouragements. Que notre seigneur Jésus-Christ vous bénisse et vous garde longtemps afin que vous puissiez voir tous vos petits enfants s’épanouir. A mes sœurs TRAORE Chantal, TRAORE Philomène, TRAORE Modestine, mon frère TRAORE Stéphane et à mes nièces Grâce et Eléonore sans oublier ma regrettée tante Celine TOURE, mes regrettées grandes sœurs adorées TRAORE Aimée, TRAORE Constance et mes regrettés cousins HALA Gnamien Jean-Marie et TRAORE Martin. A ma chérie Mandoussou TRAORE, durant ces interminables années, tu n’as cessé de m’apporter le réconfort et le soutien nécessaire pour le bon déroulement de mes études. Tu as su transformer mes doutes en espoir. Trouve dans ce travail l’expression de toute ma reconnaissance et de tout mon amour. Que le Dieu de Jacob veille sur nous et nous assiste. THESE DE DOCTORAT Remerciements TRAORE Sylvain Gnamien III REMERCIEMENTS THESE DE DOCTORAT Remerciements TRAORE Sylvain Gnamien IV Si l’Éternel ne bâtit la maison, ceux qui la bâtissent travaillent en vain. Que la gloire et l’honneur lui soient rendus pour le financement, la réalisation de ce document et pour tous ses bienfaits. Cette recherche doctorale a en effet bénéficié de l’appui financier du PASRES (Programme d’Appui Stratégique à la Recherche Scientifique en Côte d’Ivoire), de l’IFS (International Foundation for Science), de la commission fédérale des bourses pour étranger de la confédération Suisse, du projet Afrique One, du Centre Suisse de Recherches Scientifique en Côte d’Ivoire (CSRS), du projet Safe Food Fair Food 1 grâce à ILRI (International Livestock Research Institute) et la GIZ/BMZ. Nous tenons à adresser nos sincères remerciements à toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à l’élaboration de ce mémoire et à notre formation académique. Nous formulons ainsi des remerciements à l’endroit du professeur TANO Yao Serge, président de l’Université Nangui Abrogoua ainsi qu’au professeur KOUAME Patrice, Doyen de l’UFR-STA pour avoir accepté notre inscription en thèse unique à l’UFR des Sciences et Technologies des Aliments (STA). Nous sommes spécialement reconnaissants au Professeur Marina KOUSSEMON- CAMARA qui a bien voulu accepter la direction de cette thèse et qui nous a toujours encouragé, soutenu, guidé et fait confiance depuis notre Maîtrise. Nous vous devons beaucoup pour la contribution scientifique que vous avez apportée à cette thèse. Nous ne saurions poursuivre sans toutefois exprimer notre profonde gratitude au Professeur Marcel TANNER, directeur de l’Institut Tropical et de santé Publique Suisse (Swiss TPH), Leading House du Centre Suisse de Recherches Scientifiques (CSRS). Nous vous devons beaucoup, sans votre bienveillance nous ne serions certainement pas au CSRS et nous n’aurions pas pu travailler dans de meilleures conditions. Nous sommes également spécialement reconnaissants au Professeur Bassirou BONFOH, directeur du Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d’Ivoire (CSRS) et co-directeur de cette thèse qui n’a cessé de nous soutenir, de nous guider et nous encourager tout au long de cette thèse. Nous tenons à vous remercier pour la contribution scientifique que vous avez apportée à cette thèse et pour toute la confiance que vous nous avez accordée. Nos remerciements et notre sincère gratitude vont à l’endroit du Professeur Peter ODERMATT et du Professeur Jürg UTZINGER, tous deux épidémiologistes en Santé Publique à l’Institut Tropical et de Santé Publique Suisse (Swiss TPH) pour leur THESE DE DOCTORAT Remerciements TRAORE Sylvain Gnamien V disponibilité, leurs conseils et surtout pour leurs précieux appuis scientifiques lors de la rédaction des articles scientifiques. Nous n’oublierons jamais votre contribution scientifique et votre soutien durant notre stage à l’Institut Tropical et de Santé Publique de Bâle. Nous remercions particulièrement le Professeur Guéladio CISSE, Environnentaliste en Santé Publique à l’Institut Tropical et de Santé Publique Suisse (Swiss TPH) pour ses conseils avisés, son soutien et pour avoir adopté ce projet de recherche dès notre arrivée au Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d’Ivoire. Nous remercions vivement le docteur SANGARE Yaya, Secrétaire exécutif du PASRES pour ses précieux conseils, ses encouragements, sa compréhension et toute l’attention qu’il nous a accordée. Nous n’oublions pas le Professeur SANGARE pour les conseils qu’il nous a prodigués lors des évaluations de notre projet de recherche. Nous adressons nos vifs remerciements au Professeur Aka ASSOUMOU, au Professeur Koffi ADOUBRYN et au Docteur David AKA pour nous avoir accueillis au laboratoire de Parasitologie de l’UFR des Sciences Médicales d’Abidjan et pour l’appui scientifique qu’ils nous ont apporté en parasitologie. Nous remercions très sincèrement le Professeur Gilles DREYFUSS, le Professeur Roger MOYOU-SOMO, le Professeur YUKIFUMI Nawa, le Professeur David BLAIR, le Professeur Joachim FREY, le Professeur Jacob ZINSSTAG, le docteur Esther SCHELLING, le docteur Makita KOHEI et le Professeur Marie-Laure QUILLICI pour les encouragements et tout l’appui scientifique dont nous avons bénéficié depuis respectivement l’Université de Limoges, la faculté de Médecine et des Sciences Biomédicales de Yaoundé, la faculté de Médecine de Miyazaki au Japon, l’Université James Cook d’Australie, l’Institut de Bactériologie Vétérinaire de l’Université de Berne, l’Institut Tropical et de Santé Publique Suisse (TPH), l’Université Rakuno Gakuen et l’Institut Pasteur de Paris. Nous sommes très reconnaissants au docteur Solenne COSTARD pour la modélisation stochastique ainsi qu’au docteur Xavier DING pour la contribution scientifique. Nous adressons nos remerciements aux directeurs de département du Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d’Ivoire (CSRS), le docteur DAO Daouda, le Professeur KONE Inza et le Docteur Giovana RASO pour leurs conseils avisés et leur aide. Nous exprimons nos sincères remerciements aux membres du groupe de recherche Nutrition, Qualité et Analyse des risques du CSRS en particulier mademoiselle Regina THESE DE DOCTORAT Remerciements TRAORE Sylvain Gnamien VI KRABI pour son immense contribution dans les analyses bactériologiques des crustacés, le Professeur KONE Mamidou, le Docteur KONAN Georgette, le Docteur AKE Yolande, le Docteur NINDJIN Charlemagne, monsieur YOBOUET Bassa Antoine, madame KOUAME-SINA Sylvie Mireille, monsieur YAO Konan, Monsieur AHOUA Rémi, Mademoiselle YAPO Rachelle et monsieur KONE Bognan Valentin pour leur aide et leur soutien. Nous n’oublions pas de remercier tous les chercheurs du CSRS pour leur sympathie et leurs conseils avisés notamment, le Professeur KOUDOU Benjamin, le Docteur KONE Brama, le Docteur Nicolas BETSI, le professeur DONGO Kouassi, le docteur SILUE Dieudonné, le docteur Gilbert FOKOU, le docteur Mathurin KOFFI, le docteur TCHICAYA Emile, le docteur COULIBALY Jean et le docteur ESSO. Nos remerciements vont également à l’endroit de tout le personnel du CSRS et de ses services en particulier le secrétariat, la communication, le service comptabilité, la caisse et les ressources humaines et moyens généraux. Notre gratitude et nos sincères remerciements vont à l’endroit de monsieur TRAORE Mahamadou, de madame IRIE, de monsieur TOURE Sadikou et de monsieur KOUADIO Brou pour leur précieuse assistance technique et leur aide lors des analyses bactériologiques et parasitologiques des crustacés, des crachats et des selles. Nous remercions très sincèrement monsieur KOUAKOU Etienne, monsieur SILUE Bétio, Docteur DIOMANDE Métangbo, Docteur Olivier KOUADIO, Docteur KOUASSI KOUASSI Clément, monsieur KOUAKOU Boris et monsieur YEO souleymane pour l’aide apportée dans la réalisation du PowerPoint, des cartes des sites d’études et les figures. Nous remercions chaleureusement toutes les personnes avec qui nous avons collaboré lors de la réalisation de l’étude épidémiologique sur la paragonimose au Centre Antituberculeux (CAT) d’Adjamé, en particulier le Docteur Karamoko TOURE, directeur de ce centre, monsieur KONATE Ladji responsable du laboratoire de bactériologie et monsieur ANGOUA technicien au sein de ce laboratoire. Nous tenons à remercier également le Directeur du CAT de Treichville, le docteur TRAORE Mahamadou, le Docteur COULIBALY sous-directeur de ce CAT, monsieur KOFFI responsable du laboratoire de bactériologie de ce centre et monsieur KOKOLA, pour nous avoir permis de réaliser l’étude épidémiologique sur la paragonimose au sein de cet établissement. Nous formulons aussi des remerciements à l’endroit de l’inspectrice de l’enseignement primaire THESE DE DOCTORAT Remerciements TRAORE Sylvain Gnamien VII de Dabou, des directeurs des écoles primaires de N’Gattty et d’Allaba et de l’infirmier de l’hôpital de N’Gatty. Nous n’oublions pas les patients des centres antituberculeux d’Adjamé et de Treichville et les élèves des écoles primaires d’Allaba et de N’Gatty pour leur participation à l’étude. Nous n’oublions pas aussi de remercier tous les ménages que nous avons enquêtés à Abidjan, les vendeuses de crustacés et toutes les femmes qui ont accepté de participer aux différents Focus Group Discussions. Nos remerciements vont à l’endroit de notre belle famille, de nos tantes TRAORE Sita, TIO Alice, nos cousins et cousines, Hamed DIOMANDE et Madame ABALO, de notre oncle TIO Kamangnini Alphonse et de nos tontons DIARRA Mamadou, Jérôme et ABALO Germain pour leurs encouragements et leur soutien Nous n’oublions pas nos collègues et nos amis en Côte d’Ivoire et en Suisse, particulièrement, Jérôme N’DRI, Christian BOLOU, Vénance KOUADIO, Armand Villard OUREGA, Loïs DJOMAN et Désiré GADOU pour leur aide et leur soutien moral. Nous souhaitons remercier le président du conseil scientifique de l’UFR STA, ses collaborateurs et tous nos enseignants qui ont contribué de près ou de loin à notre formation et que nous n’avons pas pu citer ici. Nous ne saurions terminer sans toutefois remercier le président du jury, les rapporteurs et les examinateurs de cette thèse pour le temps qu’ils auront consacré à la lecture de ce document. Ainsi, nos sincères remerciments vont à l’endroit du Professeur KOUAME Patrice (Président du Jury), du Professeur N’GORAN Kouakou Eliézer (Rapporteur), du Professeur Ouhon Jean (Rapporteur), du Prof KACOU N’DOUBA Adèle (Examinateur) et du Professeur DOGBO Denezon Odette (Examinateur). Enfin, que tous ceux qui de près ou de loin qui nous ont apporté une aide quelconque mais que nous n’avons pas pu citer ici, nous en excusent et soient remerciés. THESE DE DOCTORAT Résumé TRAORE Sylvain Gnamien VIII RESUME THESE DE DOCTORAT Résumé TRAORE Sylvain Gnamien IX Les fruits de mer pêchés de façon traditionnelle et vendus sur les marchés en Côte d’Ivoire ne sont soumis à aucune inspection en vue de garantir leur innocuité. Cette étude a été initiée afin d’évaluer le risque sanitaire lié à leur consommation en rapport avec la contraction de la paragonimose et des infections à Vibrio. Ainsi, une recherche de Vibrio et de métacercaires de Paragonimus a été effectuée dans les crabes des genres Callinectes et Cardiosoma et dans les crevettes des genres Penaeus et Macrobrachium prélevés sur le principal marché de Dabou et sur six principaux marchés d’Abidjan. L’identification par PCR des souches présomptives de Vibrio isolées des crustacés a montré que seuls les crabes Callinectes et les crevettes Penaeus étaient contaminés par Vibrio (7,8%). Les espèces de Vibrio identifiées sont V. cholerae non O1; non O139 (24%), V. parahaemolyticus (36%) et V. alginolyticus (40%). L’identification morphologique des métacercaires isolées des crustacés a révélé l’absence de Paragonimus mais une prévalence d’infestation des crabes Callinectes et Cardisoma de 11,8% par des métacercaires d’autres trématodes. En outre, les deux enquêtes épidémiologiques sur la paragonimose humaine réalisées dans les centres antituberculeux d’Adjamé et de Treichville et dans deux écoles primaires (Dabou), n’ont pas permis d’observer des cas de paragonimose. De plus une prévalence de 22,3% de la tuberculose pulmonaire a été trouvée chez les patients et des helminthes et protozoaires intestinaux ont été retrouvés dans leurs selles et dans celles des élèves. Ces enquêtes ont permis aussi de remarquer que les élèves et les patients consomment les crustacés dans des sauces après une cuisson suffisante. Les potentiels facteurs de risque d’infections à Vibrio liés à la consommation et aux traitements des crabes et crevettes vendus sur les principaux marchés d’Abidjan et de Dabou sont essentiellement le mode de cuisson, la contamination croisée entre les crustacés et les légumes dans le panier de la ménagère, la fréquence de consommation des crustacés, les conditions et la durée de vente des crustacés, la consommation journalière des crustacés par certains ménages, la courte durée de cuisson des crustacés et la consommation de la moitié d’un crabe plat par personne au sein de certains ménages. Une évaluation de l’exposition au risque de consommation de crustacés contaminés par Vibrio a montré grâce à une modélisation stochastique que la probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat est 0, 013. Mots clés: Paragonimus, Vibrio, crabes, crevettes, protozoaires, helminthes, tuberculose, modélisation stochastique. THESE DE DOCTORAT Abstract TRAORE Sylvain Gnamien X Seafood fished traditionally and sold in informal markets of Côte d’Ivoire is not inspected to ensure their safety. This study has been initiated to assess the health risk associated with their consumption related to contraction of paragonimiasis and Vibrio infection. Thus, a study by looking for Vibrio and metacercariae of Paragonimus has been performed in crabs, Callinectes and Cardiosoma genus but also in shrimps, Penaeus and Macrobrachium genus, taken from the main market of Dabou town and six major informal markets of Abidjan. The identification by PCR of Vibrio strain isolated from crustaceans showed that only the Callinectes genus of crabs and Penaeus genus of the shrimp were contaminated by Vibrio (7.8%). The Vibrio species identified are V. cholerae non-O1, non- O139 (24%), V. parahaemolyticus (36%) and V. alginolyticus (40%). The morphological identification of metacercariae isolated from crustaceans revealed absence of Paragonimus but a prevalence of infestation of crabs Callinectes and Cardisoma at 11.8% by metacercariae of other trematode. In addition, two epidemiological surveys conducted on paragonimiasis in TB centers of Adjamé and Treichville, in Abidjan and two primary schools in Dabou failed to observe cases of paragonimiasis. A prevalence of 22.3% of pulmonary tuberculosis has been found among patients of TB centers and helminths and intestinal protozoa were found in their feces and those of students. These two cross- sectional surveys have also permitted to notice that students and patients consume crustaceans in sauce after proper cooking. Potential risk factors associated with Vibrio consumption and treatment of crabs and shrimp sold in markets of Abidjan and Dabou are mainly cooking process, cross-contamination of crustaceans and vegetables in food basket, frequency of consumption of crustaceans, conditions and duration of selling crustaceans, daily consumption of crustaceans by some households, short duration of cooking crustaceans and consumption of half of crab by person in some households. An assessment of exposure to consumption of crustaceans contaminated with Vibrio showed through stochastic modeling that the daily probability of consumption of contaminated crustaceans by Vibrio at the time of purchase is 0.013. Keywords: Paragonimus, Vibrio, crabs, shrimps, protozoa, helminths, tuberculosis, stochastic modeling. THESE DE DOCTORAT Avant-propos TRAORE Sylvain Gnamien XI AVANT-PROPOS THESE DE DOCTORAT Avant-propos TRAORE Sylvain Gnamien XII Si les produits de pêche qui sont mis en conserve subissent un contrôle sanitaire dans le but de protéger le consommateur, les crabes et les crevettes qui sont pêchés de façon artisanale et vendus sur nos marchés en Côte d’Ivoire, ne sont soumis à aucune inspection en vue de garantir leur innocuité. Comme les résultats de notre DEA ont montré que l’espèce de crabe Callinectes amnicola est fortement contaminée par les Clostridium perfringens et les coliformes fécaux, nous avons voulu rechercher d’autres germes pathogènes pour mieux appréhender la qualité des crustacés vendus sur nos marchés. Il nous a semblé opportun de proposer à nos maîtres de rechercher dans les crustacés (crabes et crevettes) vendus sur nos marchés, les bactéries appartenant au genre Vibrio et les trématodes notamment ceux appartenant au genre Paragonimus qui est à l’origine d’une trématodose alimentaire méconnue et souvent confondue à la tuberculose. Le groupe de recherche Nutrition, Qualité et Analyse des risques que nous avons intégré au sein du département Environnement et Santé du Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d’Ivoire (CSRS) s’est avéré utile pour l’évaluation du risque de contraction des infections à Vibrio et à Paragonimus suite à la consommation des crabes et des crevettes frais vendus sur les principaux marchés d’Abidjan et de Dabou. L’approche Analyse Participative des risques qui est un outil intersectoriel performant d’évaluation et de prédiction des risques nous a permis d’échanger avec les consommateurs de crustacés grâce aux Focus group discussions afin de mieux appréhender le risque sanitaire lié à la consommation des crustacés vendus sur les marchés. Ces travaux de thèse sur la recherche d’une part, de Vibrio et de métacercaire de Paragonimus dans les crustacés et d’autre part, d’œufs de Paragonimus dans les selles et les crachats que nous avons effectués au laboratoire de Parasitologie de l’UFR des Sciences Médicales d’Abidjan et aux laboratoires de Microbiologie et de Parasitologie du CSRS d’Août 2008 à Décembre 2010, s’inscrivent bien dans le souci de l’UFR des Sciences et Technologies des Aliments (STA) de l’Université Nangui Abrogoua qui est de former des professionnels de la qualité et de la sécurité alimentaire. La recherche de la tuberculose pulmonaire et de la paragonimose humaine chez les patients et les élèves a été réalisée avec les accords du Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique de Côte d’Ivoire (MESRS, décision N° 171), du Programme National de Lutte contre la Tuberculose (PNLT) et de la Commission Nationale d’Ethique ivoirienne (CNE, décision N° 1176 MSHP). Nos travaux qui traitent de la problématique des zoonoses à l’interface entre l’animal (crabe et crevette), l’homme (consommateur de crustacés) et l’environnement THESE DE DOCTORAT Avant-propos TRAORE Sylvain Gnamien XIII (lagune Ebrié) avec comme indicateurs Paragonimus et Vibrio s’inscrivent dans le concept « One Health ». Selon la Commission de l'Union européenne, le concept One Heath se définit comme « L'amélioration de la santé et du bien-être à travers (i) la prévention des risques et l'atténuation des effets des crises qui proviennent à l'interface entre les humains, les animaux et leurs environnements différents, et (ii) promouvoir une approche intersectorielle, en collaboration, approche de dangers pour la santé, comme un changement de perspective systémique de la gestion des risques ». L’approche« Une seule santé » (One Health) propose d’aborder conjointement la santé humaine, la santé animale et l’environnement. L’initiative « Une seule santé » est fondée sur le constat que dans une planète interconnectée et subissant des changements écologiques et climatiques importants, la santé, qu’elle soit humaine, animale ou environnementale, est une. Elle recommande de conduire des recherches interdisciplinaires, de mener des programmes de santé publique communs à l’homme et à l’animal, ainsi que des actions de formation et d’éducation à la santé. THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XIV TABLE DES MATIERES THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XV DEDICACE .................................................................................................................................. I REMERCIEMENTS .................................................................................................................... III RESUME ............................................................................................................................... VIII AVANT-PROPOS ...................................................................................................................... XI TABLE DES MATIERES ........................................................................................................... XIV LISTE DES TABLEAUX .......................................................................................................... XXII LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. XXV LISTE DES ABREVIATIONS................................................................................................ XXVIII INTRODUCTION ......................................................................................................................... 1 PREMIERE PARTIE: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................ 6 I. Généralités sur les crustacés ........................................................................................... 7 1. Reconnaissance et production des crustacés ................................................................. 7 1.1. Définition et répartition des crustacés .................................................................... 7 1.2. Morphologie externe des crustacés ......................................................................... 7 1.3. Production des crustacés .......................................................................................... 8 1.4. Valeur nutritionnelle et composition chimique des crustacés .............................. 8 1.5. Sexe chez les crabes et les crevettes ......................................................................... 9 2. Milieux lagunaires de pêche des crustacés en Côte d’Ivoire ....................................... 9 3. Crabes et crevettes pêchés en Côte d’Ivoire ................................................................ 10 3.1. Crabes du genre Callinectes et leurs différences morphologiques ..................... 10 3.1.1. Callinectes amnicola ......................................................................................... 10 3.1.2. Callinectes pallidus ........................................................................................... 14 3.1.3. Callinectes marginatus ...................................................................................... 14 3.2. Crabe Cardisoma armatum .................................................................................... 14 3.3. Crevettes du genre Penaeus et leurs différences morphologiques ..................... 16 3.3.1. Penaeus notialis ................................................................................................. 16 3.3.2. Penaeus kerathurus ........................................................................................... 16 3.4. Crevettes du genre Macrobrachium et leurs différences morphologiques ........ 16 3.4.1. Macrobrachium vollenhovenii ........................................................................... 19 3.4.2. Macrobrachium macrobrachion........................................................................ 19 II. Généralités sur les pathologies dues à la consommation des fruits de mer ............. 21 1. Choléra et infections à vibrions non cholériques ........................................................ 21 1.1. Bactéries du choléra et des infections à vibrions non cholériques ..................... 22 THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XVI 1.2. Pouvoir pathogène et toxinogène des bactéries impliquées dans le choléra et les infections à vibrions non cholériques ........................................................................... 26 I.2.1. V. cholerae O1 et O139 ...................................................................................... 26 1.2.2. Vibrio cholerae non O1 et non O139 ................................................................ 27 1.2.3. Vibrio parahaemolyticus ................................................................................... 28 1.2.4. Vibrio vulnificus ................................................................................................ 29 1.2.5. Vibrio alginolyticus ........................................................................................... 30 1.2.6. Vibrio mimicus ................................................................................................... 30 2. Paragonimose ................................................................................................................. 31 2.1. Définition ................................................................................................................. 31 2.2. Agents pathogènes .................................................................................................. 31 2.2.1. Position systématique ........................................................................................ 31 2.2.2. Genre Paragonimus ........................................................................................... 31 2.2.3. Morphologie ...................................................................................................... 31 2.2.3.1. Paragonimus africanus .............................................................................. 32 2.2.3.2. Paragonimus uterobilateralis ..................................................................... 32 2.2.4. Œufs et stades larvaires de Paragonimus .......................................................... 34 2.2.4.1. Œufs de Paragonimus sp. ........................................................................... 34 2.2.4.2. Miracidium ................................................................................................. 34 2.2.4.3. Cercaires ..................................................................................................... 34 2.2.4.4. Métacercaires .............................................................................................. 36 2.2.5 Cycle biologique de Paragonimus ..................................................................... 36 2.3. Hôtes intermédiaires de Paragonimus sp. ............................................................ 38 2.3.1. Gastéropodes ..................................................................................................... 38 2.3.2. Crustacés ............................................................................................................ 38 2.4. Hôtes définitifs de Paragonimus sp. ...................................................................... 38 2.5. Distribution géographique de la paragonimose humaime .................................. 42 2.6. Manifestations cliniques ......................................................................................... 44 2.7. Facteurs de risque de la paragonimose humaine ................................................. 44 2.7.1. Facteurs socio-culturels ..................................................................................... 44 2.7.1.1. Habitudes alimentaires ............................................................................... 44 2.7.1.2. Habitudes non alimentaires ........................................................................ 45 2.7.2. Facteurs écologiques et environnementaux ....................................................... 45 2.7.3. Facteurs liés à la migration des populations ...................................................... 46 THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XVII III. Généralités sur l’analyse des risques ........................................................................ 47 1. Définitions ...................................................................................................................... 47 1.1. Analyse du risque ................................................................................................... 47 1.2. Danger ..................................................................................................................... 47 1.3. Risque ...................................................................................................................... 47 2. Différents concepts de l’analyse des risques ............................................................... 47 2.1. Analyse des risques selon le Codex Alimentarius ................................................ 48 2.1.1. Evaluation du risque .......................................................................................... 48 2.1.1.1. Identification des dangers ........................................................................... 48 2.1.1.2. Evaluation de l’exposition .......................................................................... 50 2.1.1.3. Caractérisation des dangers ou évaluation du rapport dose-effet ............... 50 2.1.1.3.1 Modèles empiriques .............................................................................. 51 2.1.1.3.2 Modèles mécanistiques ......................................................................... 51 2.1.1.4. Caractérisation des risques ......................................................................... 53 2.1.2. Gestion des risques ............................................................................................ 54 2.1.3. Communication sur les risques .......................................................................... 54 2.2. Analyse des risques selon l’Organisation Mondiale de la Santé Animale (OIE) ......................................................................................................................................... 54 2.3. Analyse participative des risques .......................................................................... 54 3. Réalisation de l’analyse des risques ............................................................................. 57 DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES ............................................................................. 59 I. Matériel ........................................................................................................................... 60 1. Matériel biologique ........................................................................................................ 60 2. Réactifs et milieux de culture ....................................................................................... 61 3. Appareil et équipement ................................................................................................. 62 II. Méthodes ....................................................................................................................... 62 1. Sites d’études .................................................................................................................. 62 2. Enquête auprès des ménages et des vendeuses de crustacés pour la détermination des potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés aux traitements et à la consommation des crustacés ............................................................................................. 66 2.1. Calcul de la taille des échantillons de ménages enquêtés à Abidjan .................. 66 2.2. Critères d’inclusion des ménages .......................................................................... 67 2.3. Critères de non inclusion des ménages ................................................................. 67 2.4. Réalisation de l’enquête ménage ........................................................................... 67 THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XVIII 2 5. Enquête auprès des vendeuses de crustacés ......................................................... 68 3. Recherche de Vibrio, de métacercaires de Paragonimus et celles d’autres trématodes dans les crustacés ........................................................................................... 69 3.1. Echantillonnage des crustacés sur les marchés .................................................... 69 3.1.1. Taille des échantillons de crustacés pour la recherche de Vibrio ...................... 69 3.1.2. Taille des échantillons de crustacés pour la recherche de métacercaires de Paragonimus et celles d’autres trématodes ................................................................. 69 3.1.3. Technique de prélèvement et transport des crustacés ........................................ 69 3.1.4. Mesure de la température de vente des crustacés .............................................. 70 3.2. Recherche de Vibrio dans les crustacés ................................................................ 70 3.2.1. Préparation de la suspension-mère et des dilutions décimales .......................... 70 3.2.2. Dénombrement de Vibrio .................................................................................. 71 3.2.3. Isolement des Vibrio .......................................................................................... 71 3.2.4. Identification morphologique et biochimique ................................................... 72 3.2.5. Identification des souches présomptives de Vibrio par galeries API 20 E ........ 74 3.2.5. Identification des souches présomptives de Vibrio par galeries API 20 E ........ 74 3.2.6. Conservation des souches de Vibrio .................................................................. 74 3.2.7. Caractérisation moléculaire des espèces de Vibrio identifiées par la galerie API 20 E .............................................................................................................................. 74 3.2.7.1. Extraction de l’ADN bactérien ................................................................... 74 3.2.7.2. Confirmation de l’identification des espèces de Vibrio par PCR ............... 75 3.2.7.3. Sérotypage des souches de Vibrio cholerae ............................................... 77 3.2.7.4. Recherche de facteurs de pathogénicité chez les espèces de V. parahaemolyticus, V. alginolyticus et V. cholerae .................................................. 77 3.3. Recherche de métacercaires de Paragonimus et de métacercaires d’autres trématodes dans les crustacés ....................................................................................... 80 4. Détermination du risque d’infection à Vibrio lié à la consommation des crustacés par l’évaluation participative du risque .......................................................................... 80 4.1. Modèle utilisé pour l’évaluation du risque ........................................................... 80 4.2. Réalisation des « focus groups discussions » ou groupes de discussions ........... 82 4.3. Evaluation du risque .............................................................................................. 82 4.3.1. Identification du danger ..................................................................................... 82 4.3.2. Evaluation de l’exposition au risque ................................................................. 82 4.3.3. Evaluation du rapport dose-effet et la caractérisation du risque ....................... 84 THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XIX 5. Recherche de la paragonimose chez les patients des CAT et chez les élèves des deux écoles primaires de Dabou ................................................................................................ 84 5.1. Echantillonnage des patients et des élèves ............................................................ 84 5.1.1. Calcul de la taille des échantillons de patients et des élèves ............................. 84 5.1.2. Critères d’inclusion des patients et des élèves................................................... 85 5.1.3. Critères de non inclusion des patients et des élèves .......................................... 85 5.1.4. Prélèvement des échantillons des patients et des élèves et collecte de données sur leur consommation de crustacés ............................................................................ 85 5.2. Recherche du Bacille de Koch (BK) dans les crachats des patients ................... 86 5.3. Recherche d’œufs de Paragonimus et d’autres parasites dans les crachats et les selles des patients ........................................................................................................... 86 5.4. Recherche d’œufs de Paragonimus et d’autres parasites pathogènes dans les selles des élèves ............................................................................................................... 87 6. Analyse statistique ......................................................................................................... 88 TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION ......................................................................... 90 I. Potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés aux traitements des crustacés au cours de la vente et à la consommation des crustacés au niveau des ménages ....... 91 1. Résultats ......................................................................................................................... 91 1.1. Potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés à la consommation des crustacés ......................................................................................................................... 91 1.1.1. Description des ménages et de leurs habitudes et techniques culinaires ........... 91 1.1.2. Crustacés les plus consommés au niveau des ménages ..................................... 93 1.1.3. Contact entre les crustacés et les autres aliments dans le panier de la ménagère ..................................................................................................................................... 93 1. 2. Symptômes d’intoxication alimentaire observés au sein des ménages suite à la consommation des crustacés ......................................................................................... 93 1.3. Potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés aux traitements des crustacés ......................................................................................................................... 93 1.3.1. Mode de traitement des crustacés avant leur vente ........................................... 93 1.3.2. Durée de vente des crustacés ............................................................................. 94 1.3.3. Contenant de vente des crustacés ...................................................................... 94 1.3.4. Eléments en contact avec les crustacés lors de leur vente ................................. 94 2. Discussion ....................................................................................................................... 98 Conclusion partielle ........................................................................................................... 99 II. Présence de Vibrio dans les crustacés vendus sur les principaux marchés d’Abidjan et de Dabou .................................................................................................... 100 THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XX 1. Résultats ....................................................................................................................... 100 1.1. Prévalence de la contamination des crustacés par Vibrio ................................. 100 1.2. Contamination des crustacés par Vibrio en fonction du marché de prélèvement ....................................................................................................................................... 100 1.3. Température moyenne de prélèvement des crustacés et charge en Vibrio ...... 102 1.4. Contamination des crustacés par Vibrio en fonction du sexe des crabes plats 102 1.5. Contamination des crustacés par Vibrio selon la provenance .......................... 102 1.6. Espèces de Vibrio identifiées des crustacés par PCR ........................................ 103 1.7. Espèces de Vibrio identifiées en fonction du type de crustacés......................... 103 1.8. Absence de gènes de virulence dans les espèces de Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus et Vibrio parahaemolyticus identifiées par PCR .................................. 103 2. Discussion ..................................................................................................................... 111 Conclusion partielle ......................................................................................................... 112 III: Présence de métacercaires de trématodes dans les crustacés vendus sur les principaux marchés d’Abidjan et de Dabou ................................................................. 113 1. Résultats ....................................................................................................................... 113 1.1. Prévalence de l’infestation des crustacés par les métacercaires de trématodes ....................................................................................................................................... 113 1.2. Contamination des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction du marché de prélèvement .......................................................................................... 113 1.3. Contamination des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction de la provenance .......................................................................................................... 116 1.4. Contamination des crabes par des métacercaires de trématodes en fonction du sexe ................................................................................................................................ 116 2. Discussion ..................................................................................................................... 118 Conclusion partielle ......................................................................................................... 119 IV. Risque d’infection à Vibrio lié à la consommation des crustacés .......................... 120 1. Résultats ....................................................................................................................... 120 1.1. Evaluation du risque ............................................................................................ 120 1.1.1. Identification du danger ................................................................................... 120 1.1.2. Evaluation de l’exposition ............................................................................... 120 1.1.2.1. Paramètres de la distribution Béta ............................................................ 121 1.1.2.2. Probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat ............................................................................. 122 1.1.2.3. Analyse de la sensibilité du modèle 1 ...................................................... 122 THESE DE DOCTORAT Table des matières TRAORE Sylvain Gnamien XXI 2. Discussion ..................................................................................................................... 125 Conclusion partielle ......................................................................................................... 126 V. Présence du bacille tuberculeux dans les crachats des patients et de parasites intestinaux dans les selles des patients et des élèves ..................................................... 127 1. Résultats ....................................................................................................................... 127 1.1. Prévalence de la paragonimose humaine et de la tuberculose pulmonaire au niveau des patients des deux centres antituberculeux .............................................. 127 1.2. Prévalence de la tuberculose pulmonaire au niveau des patients des deux centres antituberculeux en fonction de leur sexe ...................................................... 127 1.3. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux au niveau des patients des deux centres antituberculeux ................................................................ 127 1.4. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux en fonction du sexe des patients ................................................................................................................... 130 1.5. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux au niveau des élèves des deux écoles primaires de Dabou .......................................................................... 130 1.6. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux en fonction du sexe des élèves des deux écoles primaires de Dabou ......................................................... 130 1.7. Symptômes de la paragonimose humaine, habitudes alimentaires et culinaires des patients et des élèves interrogés ........................................................................... 134 2. Discussion ..................................................................................................................... 137 Conclusion partielle ......................................................................................................... 139 CONCLUSION GENERALE .......................................................................................................... 140 RECOMMANDATIONS .............................................................................................................. 140 PERSPECTIVES ...................................................................................................................... 140 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 140 ANNEXES PUBLICATIONS COMMUNICATIONS THESE DE DOCTORAT liste des tableaux TRAORE Sylvain Gnamien XXII LISTE DES TABLEAUX THESE DE DOCTORAT liste des tableaux TRAORE Sylvain Gnamien XXIII Tableau I: Composition chimique et valeur nutritionnelle des crustacés pour 100 grammes de partie comestible (FAO, 1979). ................................................................... 12 Tableau II: Espèces de Vibrio potentiellement pathogènes pour l’homme (Quilici et Robert-Pillot, 2011)......................................................................................... 24 Tableau III: Caractéristiques des métacercaires chez Paragonimus africanus et Paragonimus uterobilateralis ........................................................................... 36 Tableau IV: Distribution géographique et hôtes définitifs d’espèces de Paragonimus (Blair et al., 2007). ........................................................................................... 41 Tableau V: Nombre de ménages enquêtés par commune .................................................. 67 Tableau VI: Tests utilisés pour l’identification des souches de Vibrio ............................. 73 Tableau VII: Liste des amorces utilisées pour la caractérisation des souches de Vibrio... 79 Tableau VIII : Caractéristiques socio-démographiques des ménages et leurs habitudes et techniques culinaires (n = 120) ......................................................................... 92 Tableau IX: Connaissance du choléra et de la paragonimose par les ménages et symptômes d’intoxication alimentaire liés à la consommation des crustacés au sein de ces ménages (n = 120) .......................................................................... 96 Tableau X: Pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction du genre ........................................................................................................................ 101 Tableau XI: Pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction du marché de prélèvement ................................................................................................ 101 Tableau XII : Température moyenne de prélèvement et charge des crustacés en Vibrio 104 Tableau XIII: Prévalence de contamination des crabes plats par Vibrio en fonction de leur sexe ................................................................................................................. 104 Tableau XIV: Pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction de la provenance ...................................................................................................... 105 Tableau XV: Liste des espèces de Vibrio identifiées par PCR ........................................ 106 Tableau XVI: Pourcentage d’identification des Vibrio en fonction du type de crustacés 107 Tableau XVII: Espèces de Vibrio ne possédant pas les gènes codant pour la toxine cholérique et pour les hémolysines ................................................................. 108 Tableau XVIII: Pourcentage d’infestation des crustacés par les trématodes en fonction de leur genre ........................................................................................................ 114 Tableau XIX: Pourcentage d’infestation des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction du marché de prélèvement ........................................................... 115 THESE DE DOCTORAT liste des tableaux TRAORE Sylvain Gnamien XXIV Tableau XX: Prévalence d’infestation des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction de leur provenance ....................................................................... 117 Tableau XXI: Prévalence des métacercaires de trématodes en fonction du sexe des crabes plats ................................................................................................................. 117 Tableau XXII: Distributions associées aux variables du modèle 1 ................................. 123 Tableau XXIII: Probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat ...................................................................... 123 Tableau XXIV : Résultats de la recherche du bacille tuberculeux et de Paragonimus dans les crachats selon la répartition des patients dans les centres antituberculeux (n=278) ........................................................................................................... 128 Tableau XXV: Répartition des personnes atteintes par la tuberculose selon le sexe ....... 128 Tableau XXVI: Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux chez les patients des CAT (n = 278) ............................................................................. 129 Tableau XXVII:Répartition des patients infestés par les helminthes et les protozoaires selon le sexe .................................................................................................... 131 Tableau XXVIII : Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux chez les élèves .............................................................................................................. 132 Tableau XXIX: Répartition des élèves infestés par les helminthes et les protozoaires selon le sexe ............................................................................................................. 133 Tableau XXX: Caractéristiques de deux cohortes, facteurs potentiels de risque de la paragonimose et symptômes de cette parasitose ............................................ 135 THESE DE DOCTORAT liste des figures TRAORE Sylvain Gnamien XXV LISTE DES FIGURES THESE DE DOCTORAT liste des figures TRAORE Sylvain Gnamien XXVI Figure 1 : Caractères distinctifs du sexe chez les crabes au niveau de leur abdomen ........ 12 Figure 2 : Anatomie de Callinectes sp. .............................................................................. 13 Figure 3 : Callinectes amnicola .......................................................................................... 13 Figure 4 : Callinectes pallidus ............................................................................................ 15 Figure 5 : Callinectes marginatus ...................................................................................... 15 Figure 6: Cardisoma armatum ........................................................................................... 17 Figure 7: Anatomie des crevettes ....................................................................................... 17 Figure 8 : Penaeus notialis ................................................................................................. 18 Figure 9: Penaeus kerathurus ............................................................................................. 18 Figure 10: Macrobrachium vollenhovenii .......................................................................... 20 Figure 11: Macrobrachium macrobrachion ....................................................................... 20 Figure 12: Paragonimus sp ................................................................................................ 33 Figure 13: Anatomie de Paragonimus africanus (face ventrale) ....................................... 33 Figure 14: Œuf de Paragonimus sp. ................................................................................... 35 Figure 15: Miracidium de Paragonimus sp. ....................................................................... 35 Figure 16: Métacercaire de Paragonimus africanus .......................................................... 40 Figure 17 : Cycle de Paragonimus sp. ............................................................................... 40 Figure 18: Carte de la distribution géographique de la paragonimose dans le monde ....... 43 Figure 19 : Localisation géographique des pays africains dans lesquels des cas de paragonimose ont été détectés ............................................................................ 43 Figure 20: Composantes de l’analyse de risque selon le Codex Alimentarius. .................. 49 Figure 21: Composantes de l’analyse de risque selon OIE ................................................ 56 Figure 22: Concept d’analyse participative des risques ..................................................... 56 Figure 23: Photographies des crabes des genres Cardisoma (a) et Callinectes (b), et celles des crevettes des genres Penaeus (c) et Macrobrachium (d) .............................. 60 Figure 24: Localisation géographique des grands marchés de prélèvement des crustacés à Abidjan et des CAT d’Adjamé et de Treichville ................................................ 65 Figure 25: Localisation géographique du grand marché de Dabou et des deux écoles primaires de Dabou ............................................................................................. 65 Figure 26 : Arbre de défaillance sur le risque de contraction des infections à Vibrio au niveau des ménages ............................................................................................. 81 Figure 27: Crustacés les plus consommés par les ménages ............................................... 95 Figure 28: Pourcentage des vendeuses de crustacés en fonction du délai de vente ........... 95 THESE DE DOCTORAT liste des figures TRAORE Sylvain Gnamien XXVII Figure 29: Pourcentage des vendeuses de crustacés en fonction du mode de stockage des crustacés .............................................................................................................. 97 Figure 30: Pourcentage des vendeuses de crustacés mettant des éléments en contact avec les crustacés lors de la vente ............................................................................... 97 Figure 31: Confirmation de l’identification de 4 souches de Vibrio cholerae par la recherche du gène 16S/23S ............................................................................... 109 Figure 32: Profil montrant l’absence des gènes de pathogénicité ctxA et ctxB chez 4 souches de Vibrio cholerae ............................................................................... 109 Figure 33: Confirmation de l’identification de V. parahaemolyticus par la recherche du gène toxR ........................................................................................................... 110 Figure 34: Profil montrant l’absence des gènes de pathogénicité tdh et trh chez une souche de Vibrio parahaemolyticus .............................................................................. 110 Figure 35: Photographie d’une métacercaire de trématode retrouvée dans un crabe ....... 114 Figure 36: Analyse de sensibilité du modèle 11 pour savoir quel paramètre influence la probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio sp. au moment de leur achat ................................................................................... 124 Figure 37: Diagramme décrivant la participation à deux enquêtes épidémiologiques sur la paragonimose des patients de deux centres antituberculeux d’Abidjan (A) et des élèves de deux écoles primaires de Dabou (B) en 2009 et 2010....................... 136 THESE DE DOCTORAT liste des abréviations TRAORE Sylvain Gnamien XXVIII LISTE DES ABREVIATIONS THESE DE DOCTORAT liste des abréviations TRAORE Sylvain Gnamien XXIX AFSCA : Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments BK : Bacille de Koch BNETD : Bureau National d'Études Techniques et de Développement CAT : Centre AntiTuberculeux CHU : Centre Hospitalier Universitaire CI : Côte d’Ivoire CIRAD : Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement CNR : Centre National de Référence CSAO : Club du Sahel et de l'Afrique de l'Ouest DGAL : Direction Générale de l'Alimentation EPA : Eau Peptonée Alcaline FAO : Food and Agriculture Organisation HACCP : Hazard Analysis of Critical Control Point InVS : Institut de Veille Sanitaire LDC : Lysine DéCarboxylase ODC : Ornithine DéCarboxylase OMS : Organisation Mondiale de la Santé OIE : Office International des Epizooties (Organisation Mondiale de la Santé Animale) ONPG : OrthoNitroPhénylGalactopyranoside RM : Rouge de Méthyle TCBS : Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose TIAC : Toxi-Infection Alimentaire Collective UE : Union Européenne UFC : Unités Formant Colonies USD : United States Dollar VP : Voges Proskauer THESE DE DOCTORAT Introduction TRAORE Sylvain Gnamien INTRODUCTION THESE DE DOCTORAT Introduction TRAORE Sylvain Gnamien 2 Dans de nombreuses régions du monde, les produits de la pêche font partie du régime alimentaire des populations et constituent une importante source de protéine alimentaire. Cependant, ces produits sont pêchés dans des eaux de surface devenues vectrices et réceptrices de toute sorte de polluants (Festy et al., 2003). Selon le lieu de pêche, il est possible qu’un nombre de germes pathogènes puissent contaminer ces produits de la pêche. Ainsi les produits de pêche peuvent transmettre des bactéries pathogènes dont certaines sont d’origine intestinale (Salmonella sp, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum) et principalement des bactéries du genre Vibrio et Clostridium (China et al., 2003). Ils peuvent aussi provoquer des intoxications chez l’homme dont les plus fréquentes sont le scombrotoxisme (intoxication par histamino-formation dans la chair de poissons bleus) et la ciguatera liée à la production de ciguatoxines dans les poissons récifaux (Haro, 2008). De plus, ces produits de pêche peuvent véhiculer des parasites (nématodes comme Anisakis agent de l’anisakidose ou Dioctophyme renale agent d’infections rénales, trématodes comme Clonorchis sinensis, agent de la distomatose à douve de Chine, Echinostoma ilocanum agent de l’échimostomose ou Paragonimus sp, agent de la paragonimose) (Huss, 1996). Ces fruits de mer qui peuvent être contaminés après la pêche par des germes exposant les consommateurs à des dangers susceptibles de provoquer de graves affections alimentaires, posent souvent dans les pays tropicaux des problèmes tant hygiéniques que toxicologiques et économiques (Diop et al., 2010). Parmi ces dangers, les vibrions constituent un sujet de préoccupation, compte tenu du fait de certaines espèces bactériennes du genre Vibrio, considérées aujourd'hui comme des pathogènes émergents, qui sont impliquées dans les infections d’origine alimentaire chez l’homme après ingestion de produits de la pêche contaminés (Cohen et Karib, 2007). En effet, depuis quelques années, l’incidence des infections à Vibrio parahaemolyticus est en constante et régulière progression dans le monde (Hara-Kudo et al., 2003). Ainsi pour protéger le consommateur, différentes technologies basées sur le froid, la chaleur ou utilisant des agents chimiques de conservation ont été développées afin d’étendre la durée de conservation des produits de la pêche (Diop et al., 2010). Des stratégies de prévention innovatrices ont été aussi mises au point pour assurer la sécurité sanitaire des aliments. Deux des plus importantes et des plus récentes sont l’analyse du THESE DE DOCTORAT Introduction TRAORE Sylvain Gnamien 3 risque et le système HACCP pour l’analyse des dangers et la maîtrise des points critiques (FAO/OMS, 2002). En dépit de ces efforts, on estime que dans les pays développés, un tiers de la population est victime chaque année de maladies d’origine alimentaire. La situation est encore plus grave dans les pays en développement où les cas signalés ne représentent que la partie visible de l’iceberg (Lebres, 2006). L'incidence mondiale des maladies d'origine alimentaire est difficile à estimer. Dans la plupart des pays, la déclaration des maladies d'origine alimentaire n'est pas obligatoire et l'aliment incriminé est rarement conservé en vue de l'analyse et le véhicule de l'agent pathogène n'est pas identifié (Huss, 1996). Mais il a été signalé que dans la seule année de 2005, 1,8 million de personnes sont mortes de maladies diarrhéiques. Une grande proportion de ces cas était attribuée à la contamination de nourriture et d'eau potable (OMS, 2007). En 2000, 56 pays ont rapporté 137 071 cas de choléra à l’OMS; 87 % des cas provenaient de l’Afrique (OMS, 2000). Au Maroc, 7 118 cas de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) ont été rapportés entre 2000 et 2004 dont plus de 86 % sont d’origine bactérienne (Cohen et al., 2006). Les produits de la pêche contaminés sont responsables de 10 % des cas de TIAC déclarés au Maroc (Anonyme 1, 2005). En Algérie, les toxi-infections alimentaires sont nombreuses, de l’ordre de 300 000 à 500 000 cas par an (de 1 à 1,7 % de la population), (Rastoin, 2007). En Côte d’Ivoire, des cas de paragonimose humaine, une trématodose alimentaire confondue le plus souvent avec la tuberculose pulmonaire et due à la consommation de crabes crus ou mal cuits (Keiser et Utzinger, 2009), ont été détectés. En effet, le premier patient atteint de cette anthropozoonose alimentaire a été dépisté en 1975 et par la suite, quatorze autres cas ont été rapportés jusqu’en 1999 (Aka et al., 1995 ; Adoubryn et al.,1999). Des études épidémiologiques effectuées sur cette maladie de 2004 à 2006 au centre antituberculeux de la ville de Divo (au sud-ouest), au Centre Hospitalier Régional de Lakota (sud-ouest) et au centre de santé rural de l'île de Lauzoua (au sud) ont permis de trouver respectivement aucun cas sur 167 patients, 3 cas sur 92 patients (3,26%) et 5 cas sur 17 patients (29,41%), (Aka et al., 2008 a ; Aka et al., 2008 b ; Aka et al., 2009). En 1985, une épidémie de diarrhée est apparue en Côte d’Ivoire au cours des mois de fortes précipitations (juin, juillet), causée principalement par Vibrio parahaemolyticus (Tiékoura et al., 2010). En 2001, des foyers de choléra, occasionnant des pertes en vie humaine, ont été déclarés dans plusieurs régions et villes du pays (Tanon et al., 2004). De THESE DE DOCTORAT Introduction TRAORE Sylvain Gnamien 4 2001 à 2005, 11 874 cas de choléra ont été notifiés en Côte d’Ivoire avec 564 décès. Environ 60 % des cas ont été enregistrés à Abidjan (Ekra et al., 2009). En 2002 Abidjan seul a enregistré 3445 cas de choléra, soit 83,88% (FAO/OMS, 2005). Comme le commerce des crustacés est important en Côte d’Ivoire, étant donné l’ignorance de leur qualité sanitaire, il est plus que nécessaire de mieux évaluer le risque que représente leur consommation. Ainsi, pour répondre à cette préoccupation, cette étude qui s’intègre dans le concept « One Health » et aborde la problématique des zoonoses à l’interface entre l’animal, l’homme et l’environnement avec comme indicateurs Paragonimus et Vibrio a été entreprise. La première hypothèse ayant suscité cette étude est celle selon laquelle les deux espèces de crabes, Liberonautes latidactylus et Callinectes marginatus connues à ce jour en Côte d’Ivoire, ne sont pas les seuls hôtes intermédiaires de Paragonimus et que hormis les espèces Paragonimus africanus et Paragonimus uterobilateralis reconnues comme espèces de Paragonimus dans ce pays, d'autres espèces de Paragonimus et de trématodes existeraient dans le pays. La seconde hypothèse est celle selon laquelle les crabes et crevettes vendus à Abidjan seraient contaminés par Vibrio, en raison de la présence de ces bactéries dans les eaux côtières et estuariennes dans lesquelles ils sont pêchés. La troisième hypothèse est basée sur le fait que parmi les patients dits tuberculeux et les enfants d’âge scolaire des zones de pêches de crabes, il existe des cas de paragonimose à cause respectivement de l’insuffisance de diagnostic différentiel entre ces deux maladies pour les premiers et de l’insuffisance de cuisson des crabes sur le lieu de pêche pour les derniers. Enfin la dernière hypothèse est celle selon laquelle l’endémicité et l’émergence de la paragonimose et des infections à Vibrio sont la résultante de facteurs socioculturels. L’objectif général de cette étude est donc d’évaluer le risque de contraction de la paragonimose et des infections à Vibrio lié à la consommation des crustacés vendus sur les marchés. Les objectifs spécifiques de cette étude sont :  déterminer les prévalences de contamination des crabes et des crevettes vendus sur les marchés par les espèces de Vibrio et de Paragonimus;  caractériser les espèces de Vibrio et de Paragonimus isolées des crabes et des crevettes vendus sur les marchés; THESE DE DOCTORAT Introduction TRAORE Sylvain Gnamien 5  déterminer la prévalence de la paragonimose humaine chez les patients des centres antituberculeux et chez les enfants d’âge scolaire;  déterminer les facteurs de risque de la paragonimose et les potentiels facteurs de risque d’infections à Vibrio liés à la consommation des crabes et des crevettes. La logique de nos travaux s’enchaîne en trois parties, de la manière suivante : (1) La première partie constitue la revue bibliographique où nous donnons successivement quelques généralités sur les crustacés, sur les principales pathologies liées à la consommation des fruits de mer et sur l’analyse des risques. (2) La deuxième partie, présente l’ensemble du matériel et des méthodes utilisés pour atteindre les différents objectifs spécifiques (3) La troisième partie présente les principaux résultats suivis de leur discussion et de leur conclusion partielle. La conclusion générale, les recommandations et les perspectives de recherche qui se dégagent de ce travail sont abordées après la troisième partie. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 6 PREMIERE PARTIE: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 7 I. Généralités sur les crustacés 1. Reconnaissance et production des crustacés 1.1. Définition et répartition des crustacés Les crustacés constituent l’une des classes de l’embranchement des arthropodes (insectes, arachnides, myriapodes) qui regroupe les animaux au corps segmenté dont chaque segment est relié aux autres par une membrane articulaire et porte une paire d’appendices. Leur corps est recouvert par une carapace chitineuse secrétée par l’épiderme et que l’animal renouvelle plusieurs fois au cours de sa croissance (Pinot, 2003). Les crustacés décapodes constituent un groupe d'animaux très abondants et diversifiés, puisqu’ils représentent 75-80% de toutes les espèces animales décrites de l’embranchement des arthropodes (Bodin, 2005). Ils jouent un rôle important dans la plupart des écosystèmes marins, occupant une grande variété de niches trophiques (Cartes et al., 2010). Les crustacés sont quasiment les seuls arthropodes à s’être adaptés à la vie marine (branchies), ils comptent environ 45 000 espèces qui présentent une grande diversité de formes et de modes de vie allant du zooplancton marin jusqu'aux énormes crabes (crabe géant Macrocheira kaempferi qui a près de 4 m d’envergure) (Bodin, 2005). Les décapodes comptent plus de 10 000 espèces et les crustacés aquatiques font presque tous partie de l’ordre des décapodes. Pour les seuls crabes, l’inventaire mondial de Ng et al. (2008) a permis de recenser près de 6 800 espèces et sous-espèces. 1.2. Morphologie externe des crustacés Les crustacés sont fondamentalement constitués de trois régions : - la tête qui porte les antennes, 2 paires servant au toucher et à l'odorat (détection mécanique et chimique), des yeux pédonculés et composés comme ceux des insectes, des mandibules qui sont des pièces massives, dentées et broyeuses. - le thorax qui porte 5 appendices locomoteurs qui contiennent les branchies, 3 appendices masticateurs et des pattes mâchoires qui jouent un rôle alimentaire. Chez certains animaux comme le crabe ou la langouste, la tête et le thorax fusionnent pour former le céphalothorax. - l'abdomen est articulé et porte des appendices nécessaires à la nage (Miserey, 2005). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 8 1.3. Production des crustacés En 2009, la production mondiale totale de poissons, de crustacés et de mollusques était estimée à 144,6 millions de tonnes et la production aquacole mondiale à 55,7 millions de tonnes pour une valeur de cette production aquacole estimée à 105,3 milliards d'USD à cette même année (FAO, 2011). La crevette est le produit de la mer le plus consommé dans le monde et représente environ 16 % du commerce international, soit 12 milliards de dollars américains (Anonyme 2, 2006 a). Dans les pays en développement, les exportations nettes des produits de la pêche étaient estimées à 25,5 milliards d’USD en 2009 et en 2010 la production totale de poissons, de crustacés et de mollusques était estimée en Côte d’Ivoire à 71 812 tonnes (FAO, 2011). En Côte d’Ivoire, la pêche artisanale, bien qu’elle soit la plus ancienne, demeure toujours mal connue. Les données la concernant sont soit parcellaires, soit peu fiables (FAO, 2008). La production des lagunes Ebrié, Aby, et Grand-Lahou où se pratique la pêche lagunaire, totalise près de 25 000 tonnes de poisson et de crustacés. Dans le milieu lagunaire deux espèces de crabes sont exploitées : Callinectes amnicola avec un tonnage de 7 000 tonnes, principalement pêché dans les lagunes (Grand-Lahou, Ebrié et Aby) et Cardiosoma armatum, dont le tonnage avoisine 800 tonnes, est pêché à Grand-Lahou et à Fresco (FAO, 2004). Les crevettes juvéniles appartenant à l’espèce Penaeus notialis font partie des ressources lagunaires exploitées et cette exploitation est active à Assinie, à Grand-Lahou et à Dabou (points de jonction mer-lagune) où la crevette, trouve l’écosystème adéquat pour boucler son cycle. Celui-ci comprend une phase de croissance en lagune et une phase de maturité des gonades et d’éclosion en mer (FAO, 2004 ; FAO, 2008). 1.4. Valeur nutritionnelle et composition chimique des crustacés La teneur en lipides des mollusques et crustacés est égale à celle des poissons maigres (0,5 % à 5 %). Les crustacés ont une teneur en cholestérol supérieure à des valeurs comprises entre 50 mg à 70 mg pour 100 g. En revanche les coquillages (huîtres, moules, palourdes) contiennent des quantités relativement importantes de stérols mais le cholestérol ne représente en fait qu’un tiers de ces stérols. Les coquillages contiennent un peu de glycogène. Les coquillages et crustacés ont la particularité d’être plus riches en divers minéraux (calcium, zinc, fer, sodium) (Desalme et al., 2004). Le tableau I donne la composition chimique et la valeur nutritionnelle de quelques crustacés (homard, crabe, crevette) pour 100 grammes de partie comestible (FAO, 1979). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 9 1.5. Sexe chez les crabes et les crevettes Il existe un dimorphisme sexuel entre le mâle et la femelle chez les crustacés. Les œufs sont généralement émis directement dans l’eau, ils sont portés par la femelle, suspendus à son abdomen. Le nombre d’œufs portés est en corrélation avec la taille (Miserey, 2005). Chez les crabes, le mâle dispose d’un abdomen plus étroit et pointu contrairement à celui de la femelle qui est plus large. La figure 1 donne les caractères distinctifs du sexe chez les crabes. Chez les crevettes, le mâle de certaines espèces possède de grandes pinces asymétriques. L’orifice génital se trouve au niveau de la cinquième paire de péréiopodes. Il présente une pointe ou protubérance au centre du premier somite (segment) abdominal, perceptible au toucher (Rao et Tripathi, 1993). La femelle possède des pinces de tailles presque identiques et l’orifice génital se trouve au niveau de la troisième paire de péréiopodes. 2. Milieux lagunaires de pêche des crustacés en Côte d’Ivoire Le système lagunaire ivoirien se compose d’Est en Ouest des quatre lagunes que sont les lagunes Aby, Ébrié, Grand-Lahou et N’Gni de Fresco (Kouassi, 2010). Situées le long du rivage nord du golfe de Guinée, entre 2°50′ et 5°25′ de longitude ouest, les trois principales lagunes, la lagune Ebrié (566 km2), la lagune Aby (425 km2) et la lagune de Grand-Lahou (210 km2) où se pratique la pêche lagunaire, ont une superficie totale de 1.200 km2. Les trois principaux canaux joignant ces différentes lagunes sont : le canal d’Azagny, long de 17 km et reliant les lagunes de Grand-Lahou et Ebrié, le canal de Groguida, qui connecte deux branches de la lagune de Grand-Lahou avec une longueur de 1 km et le canal d’Assinie qui lie la lagune Ebrié à celle d’Aby avec une longueur de 48 km (FAO, 2004). La lagune Ebrié constitue l'étendue saumâtre tropicale la plus vaste de l'Afrique Occidentale communiquant avec l'Océan Atlantique par le canal de Vridi construit en 1950 et elle reçoit de l’eau douce par le fleuve Comoé et par les rivières Agnéby et Mé (Albaret et Laë, 2003). Assez longue (120 km), elle est peu profonde (4,5 m en moyenne), la salinité est proche de zéro aux extrémités ouest et est, la température oscille entre 25 et 32°C et elle est bordée par les villes d’Abidjan, de Grand-Bassam, de Bingerville et de Dabou (Pages et al., 1980). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 10 En lagune Ebrié, plusieurs études se sont focalisées sur la contamination chimique des échantillons de poissons, d’arche (Arca senilis), d’huîtres (Crassostrea gasar), de crabes (Callinectes amnicola) (Métongo et Gbocho, 2007) et ont révélé que les échantillons provenant des zones urbaines sont plus contaminés que ceux des secteurs ruraux. Une étude menée par Mamadou et al. (2008) a révélé que les teneurs en plomb du gastéropode Tympanotonus fuscatus radula dépassent largement les normes de consommation des produits de l’Union Européenne et de l’OMS. Entre 1985 et 1990, de nombreuses infections à vibrionacées ont périodiquement été signalées dans les zones habitées qui bordent la lagune (Kouassi et al., 1992). L’analyse des données microbiologiques de la lagune Ebrié donne des valeurs moyennes annuelles en streptocoques dépassant les normes OMS de qualité des eaux de surface à usage récréatif (OMS, 2003). 3. Crabes et crevettes pêchés en Côte d’Ivoire En lagune Ebrié, les crustacés sont principalement représentés par des espèces appartenant à trois familles de l’ordre des décapodes (Lhomme, 1994) : - les Palaemonidae (crevettes du genre Macrobrachium) - les Penaeidae (crevettes du genre Penaeus) - les Portunidae (crabes du genre Callinectes avec les espèces Callinectes amnicola et Callinectes pallidus qui sont les plus abondantes). 3.1. Crabes du genre Callinectes et leurs différences morphologiques Une révision de la systématique des brachyoures d'Afrique de l’Ouest a été publiée par Manning et Holthuis (1981). Sur les trois espèces présentes sur les côtes ouest- africaines depuis la Mauritanie jusqu’à l’Angola, C. amnicola, C. pallidus et C. marginatus, seules les deux premières sont beaucoup rencontrées en Côte d’Ivoire. La figure 2 donne les termes techniques des crabes Callinectes sp. 3.1.1. Callinectes amnicola L’espèce de crabe Callinectes amnicola, dont la largeur de la carapace est deux fois ou légèrement plus que sa longueur (Fischer et al., 1981), joue un rôle biologique essentiel dans l’écosystème de la lagune Ebrié. En effet, son régime alimentaire omnivore en fait un maillon important dans l’écosystème en particulier entre la production benthique et les niveaux supérieurs de la chaîne alimentaire (Charles-Dominique et Hem, 1981). Cette THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 11 espèce de crabe dont la longueur maximum de la carapace est 7,5 cm et la largeur 15,5 cm (Fischer et al., 1981) a une grande importance économique par sa valeur marchande et par ses prises en Côte d’Ivoire. On la retrouve au niveau des fonds vaseux dans les zones de mangrove et des embouchures de rivières (Defelice et al., 2001). Elle est souvent pêchée dans les lagunes Ouest-Africaines qui constituent l’exutoire normal des déchets d’origines diverses. Elle est très appréciée par les populations sub-sahéliennes du Sénégal en Angola (Charles-Dominique et Hem, 1981 ; Lawal-Are et Kusmiju, 2000). Manning et Holthuis (1981) indiquent dans leurs travaux sur les crabes du genre Callinectes que C. amnicola est une espèce de crabe d’eaux saumâtres oligohalines (salinité 0,5 à 5 g/L) et même d’eaux douces. La figure 3 montre un crabe C. amnicola. Le cycle biologique de C. amnicola se déroule essentiellement en lagune. Cependant les femelles ovigères peuvent être observées en mer au large de Grand Bassam, au sud d’Abidjan où elles sont soumises à la flore marine et cette migration serait liée à la ponte (Charles-Dominique et Hem, 1981). La reproduction de C. amnicola en lagune Ébrié est caractérisée par la migration des femelles des zones dessalées situées à l'ouest de Dabou (au sud-ouest de la Côte d’Ivoire à 49 km d’Abidjan), vers les secteurs méso- et euhalins proches du canal de Vridi, au sud d’Abidjan. Cette migration s'accompagne d'une maturation des gonades. Les mâles, contrairement à ceux des deux autres espèces (C. pallidus et C. marginatus) ont les gonopodes plus longs, sont beaucoup plus sédentaires et se trouvent dans les eaux oligohalines, parfois dans les eaux douces (Lhomme, 1994). Une étude réalisée au Nigéria a montré que chez cette espèce de crabe, la fécondité et la masse sont fortement plus corrélées que la fécondité et la taille (Arimoro et Idoro, 2007). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 12 Tableau I: Composition chimique et valeur nutritionnelle des crustacés pour 100 grammes de partie comestible (FAO, 1979). Constituants Valeur Eau (mL) 77 Energie (calories) 94 Protéines (g) 18 Lipides (g) 1,5 Glucides (g) 1,5 Cellulose (g) 2 Calcium (mg) 100 Fer (mg) 5 Thiamine (mg) 0,05 Riboflavine (mg) 0,10 Niacine (mg) 2,50 Déchet (0/0) de l’aliment tel qu’acheté 63 Figure 1 : Caractères distinctifs du sexe chez les crabes au niveau de leur abdomen Source : Miserey, 2005 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 13 Figure 2 : Anatomie de Callinectes sp. Source : Fischer et al., 1981 Figure 3 : Callinectes amnicola Source : Fischer et al., 1981 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 14 3.1.2. Callinectes pallidus Ce crabe, à la différence des deux autres espèces, a la carapace très large, presque 2,5 fois plus large que longue et plus plate avec l’épine latérale la plus longue (environ trois fois plus longue que la dent précédente). La surface de la carapace est uniformément garnie de granules fins. La largeur maximum de la carapace est de 10,9 cm et la longueur 4,5 cm (Fischer et al., 1981). Le cycle biologique de C. pallidus se déroule en mer et en lagune (Lhomme, 1994). La figure 4 montre un crabe C. pallidus. 3.1.3. Callinectes marginatus A la différence de C. amnicola qui a une carapace plus convexe avec des granulations plus grossières et une crête granuleuse pratiquement droite sans inflexion s’étendant vers l’intérieur depuis l’épine latérale, la carapace du crabe Callinectes marginatus est légèrement plus plate et la granulation plus fine. La crête s’étendant de l’épine latérale vers le centre a une nette inflexion près de son milieu. La largeur de la carapace est un peu plus de deux fois sa longueur et la largeur maximum de la carapace est de 9,7 cm (Fischer et al., 1981). La figure 5 montre un C. marginatus. 3.2. Crabe Cardisoma armatum L’espèce Cardisoma armatum, généralement appelée " Crabe poilu ″ par les populations lagunaires, est un décapode terrestre omnivore vivant dans les milieux margino-littoraux de l’Afrique de l’Ouest et se nourrissant principalement de fruits (avocats, bananes, graines de palme...), de végétaux (épinards, feuilles de palétuvier, salades…) et d’algues. (Le Loeuff et Zabi, 1993). A la différence des crabes appartenant au genre Callinectes, les crabes Cardisoma armatum ont une carapace en forme de pomme et lisse, sans dents antéro-latéraux (Akin-Oriola et al., 2005). La figure 6 montre un crabe C. armatum. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 15 Figure 4 : Callinectes pallidus Source : Fischer et al., 1981 Figure 5 : Callinectes marginatus Source : Fischer et al., 1981 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 16 3.3. Crevettes du genre Penaeus et leurs différences morphologiques Les crevettes Penaeus sont des arthropodes, des malacostracés qui font partie de l’ordre des décapodes (Doquin, 2004). Une révision systématique des crevettes commercialisables a été effectuée par Holthuis en 1980. En Côte-d'Ivoire, la seule espèce importante sur le plan économique est Penaeus notialis (FAO, 2004). La caractéristique essentielle du cycle des crevettes pénéides est son caractère mixte : adultes et larves se rencontrent dans le milieu marin, post-larves et juvéniles dans les milieux saumâtres lagunaires et estuariens. La figure 7 donne les termes techniques des crevettes en général. 3.3.1. Penaeus notialis Penaeus (Farfantepenaeus) notialis a un rostre muni généralement de 9 dents sur le bord dorsal et deux dents sur le bord ventral. Le dernier (sixième) segment abdominal porte un sillon dorso-latéral bien défini de chaque côté de la carène dorsale. La longueur totale maximum est de 23 cm chez les femelles et 17 cm chez les mâles (Fischer et al., 1981). La figure 8 montre une crevette P. notialis. 3.3.2. Penaeus kerathurus Penaeus (Melicertus) kerathurus, contrairement à l’espèce Penaeus (Farfantepenaeus) notialis a un rostre légèrement recourbé vers le haut à l’extrémité, avec généralement 11 dents sur le bord dorsal et une seule forte dent sur le bord ventral. Le dernier (sixième) segment abdominal ne porte aucun sillon dorso-latéral de chaque côté de la carène dorsale. La longueur totale maximum est de 23,5 cm chez les femelles et 18 cm chez les mâles (Fischer et al., 1981). La figure 9 montre une crevette P. kerathurus. 3.4. Crevettes du genre Macrobrachium et leurs différences morphologiques Le genre Macrobrachium comprend plus de 200 espèces (Short, 2004). En Côte- d'Ivoire, sept espèces sont recontrées : M. chevalieri, M. dux, M. felicinum, M. macrobrachion, M. raridens, M. thysi et M. vollenhovenii (Lévêque et al., 1983). Parmi ces sept espèces, deux de taille importante sont plus rencontrées dans les cours d’eau en Côte d’Ivoire: M. macrobrachion et M. vollenhovenii (N’zi et al., 2008). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 17 Figure 6: Cardisoma armatum Source : Fischer et al., 1981 Figure 7: Anatomie des crevettes Source : Fischer et al., 1981 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 18 Figure 8 : Penaeus notialis Source : Fischer et al., 1981 Figure 9: Penaeus kerathurus Source: Fischer et al., 1981 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 19 3.4.1. Macrobrachium vollenhovenii Les connaissances sur les Macrobrachium sont parcellaires et essentiellement basées sur les travaux déjà anciens de Ville (J.P) parus en 1970 et 1972, avec un accent mis sur M. vollenhovenii, espèce apparemment la plus commune. Les individus appartenant à l’espèce Macrobrachium vollenhovenii ont la longueur du carpe inférieure ou égale à celle du mérus. Cette espèce est de grande taille, les pattes de la deuxième paire sont grandes et larges. La pointe du rostre est inférieure à l’extrémité antérieure de l’écaille antennaire. La figure 10 montre une crevette M. vollenhovenii. 3.4.2. Macrobrachium macrobrachion Chez Macrobrachium macrobrachion, la longueur du carpe est égale à celle du mérus. C’est une espèce de taille moyenne, les pattes sont plus ou moins identiques, moyennes et moins larges. La pointe du rostre est légèrement supérieure ou égale à l’extrémité antérieure de l’écaille antennaire. Si la détermination de ces deux espèces de crevettes appartenant au genre Macrobrachium est relativement aisée chez les mâles adultes (à partir de caractères morphologiques de la deuxième paire de pattes, surtout par la forme des pinces), il n'en est pas de même chez les formes juvéniles et les femelles adultes dont l'identification est délicate (Konan et al., 2008). La figure 11 montre une crevette M. macrobrachion. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 20 Figure 10: Macrobrachium vollenhovenii Source : Fischer et al., 1981 Figure 11: Macrobrachium macrobrachion Source : Fischer et al., 1981 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 21 II. Généralités sur les pathologies dues à la consommation des fruits de mer Divers facteurs liés à la production des fruits de mer et à leur environnement marin expliquent le rapport entre leur consommation et l’apparition de certaines pathologies. D’une part, les fruits de mer sont consommés crus ou insuffisamment cuits (OMS/FAO, 2004), d’autre part, ils proviennent d’eaux souvent polluées (Festy et al., 2003) et la composition de leur microflore dépend de la flore de ces eaux, de la flore de recontamination pendant les différentes étapes de leur procédé de transformation et des facteurs environnementaux qui vont permettre la croissance bactérienne (Leroi, 2009). Il existe plus de 200 maladies infectieuses bactériennes, virales ou toxiques transmises par l’alimentation (Rastoin, 2007). Cependant, les principales maladies dues à la consommation de fruits de mer pollués sont les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes, les salmonelloses, l’infection à Vibrio parahaemolyticus, l’hépatite virale de type A, l’intoxication paralysante par les fruits de mer, les intoxications chimiques, le choléra et les trématodoses alimentaires dont la paragonimose (OMS, 1977). Dans la suite de ce chapitre, nous nous limiterons essentiellement à la paragonimose humaine, au choléra et aux infections à Vibrio non cholériques qui font l’objet de notre étude. 1. Choléra et infections à vibrions non cholériques Le choléra est une infection intestinale aiguë causée par l’ingestion de nourriture ou d’eau contaminées par Vibrio cholerae O1 et O139 toxinogène (Reidl et Klose, 2002). Le choléra est une maladie importante sur le plan mondial qui affecte le plus, les pauvres et s’étend progressivement vers des régions auparavant épargnées (Harris et al., 2010). Depuis le début des années 90, une augmentation spectaculaire des cas de choléra a été observée au niveau mondial avec le changement climatique, la pauvreté et la mobilité des personnes (Jutla et al., 2011 ; Mutreja et al., 2011). L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) estime entre 3 et 5 millions par an, les cas de choléra dans le monde (OMS, 2011 a), et en 2010, des cas de choléra ont été signalé dans 48 pays (OMS, 2011 b). Entre 2001 et 2009, 93 à 98% de tous les cas de choléra signalés provenaient d'Afrique et en 2010, 56% de tous les cas ont été rencontrés à Haïti (OMS, 2011 b). En Côte d’Ivoire, le choléra sévit à l'état endémo-épidémique depuis trois décennies et l’agent responsable de cette maladie est V. cholerae O1 (Tiékoura et al., 2010). L’incidence des infections à vibrions non cholériques est difficile à connaître, en particulier pour les formes les moins sévères. En effet, les cas de vibrioses non cholériques THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 22 n’étant pas à déclaration obligatoire, les souches ne sont envoyées au Centre National de Référence que par les laboratoires ayant des problèmes d’identification au niveau de l’espèce, ou souhaitant une confirmation de leur identification. Cependant, un bilan de la morbidité et de la mortalité dues aux maladies infectieuses d’origine alimentaire en France, publié en 2004 par l’Institut de Veille Sanitaire (InVS) en collaboration avec l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA), conclut que, même si l’exhaustivité du Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra (CNRVC) n’est pas connue, sa représentativité semble bonne pour les cas graves d’hospitalisation dans la grande majorité des infections à vibrions non cholériques. Cette étude souligne par ailleurs qu’il est possible que le nombre de cas confirmés ne représente qu’une petite partie du nombre de cas réels en raison d’un sous-diagnostic important, en particulier pour les formes bénignes, du fait que la mise en évidence de Vibrio dans les selles nécessite l’emploi d’un milieu de culture sélectif, le milieu TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose) qui n’est pas utilisé en routine dans les laboratoires de microbiologie clinique. Les cas de gastro-entérites liés à ces vibrions étant probablement sous-diagnostiqués, la fréquence de ces infections est donc sous-estimée et le recensement non exhaustif (Quilici et al., 2005). Les infections humaines à vibrions non cholériques (VNC) surviennent principalement en saison chaude. Elles sont dues à la consommation de fruits de mer et se manifestent alors sous forme de gastro-entérites et de septicémies (Cohen et al., 2007). La pathogénicité chez l’homme dépend de la souche infectante et de l’état initial du sujet contaminé. Toute personne est susceptible de développer une gastro-entérite à Vibrio après ingestion de produits contaminés à dose suffisante (Cohen et al., 2007). L’expression clinique et la gravité des infections à vibrions non cholériques sont liées le plus souvent à des pathologies sous-jacentes dont les plus fréquentes sont les cancers, l’immunodépression, le diabète, les hépatopathies et les antécédents de chirurgie digestive (Vaillant et al., 2004). 1.1. Bactéries du choléra et des infections à vibrions non cholériques Le choléra et les infections à vibrions non cholériques sont dus à des bactéries appartenant au genre Vibrio, lequel genre fut défini initialement par Véron en 1965. Le premier agent décrit dans ce genre est Vibrio cholerae qui fut initialement observé par l’anatomiste italien Filipo Pacini en 1854 à Florence (sur des cadavres de patients morts du choléra) et isolé en 1883 par Robert Koch en Inde. Le genre Vibrio appartient à la famille THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 23 des Vibrionaceae laquelle a été restreinte à ce seul genre sur la base des travaux effectués en 2004 par Thompson et ses collaborateurs sur le séquençage des ARNr 16 S (Thompson et al., 2004). En 2005, les travaux effectués par Thompson et ses collaborateurs sur l’analyse de séquences génomiques multiples ont permis de distinguer plusieurs groupes de souches au sein du genre Vibrio laissant entrevoir une évolution de la taxonomie des vibrions dans les prochaines années (Thompson et al., 2005). Les Vibrio sont des bacilles à Gram négatif, droits ou incurvés, d’un diamètre compris entre 0,5 et 0,8 µm et d’une longueur comprise entre 1,4 et 2,6 µm (Cohen et Karib, 2007). Ils présentent une mobilité polaire due à un seul flagelle. Ils sont aéro- anaérobies facultatifs. Toutes les espèces de Vibrio, à l’exception de V. metschnikovii et de V. gazogenes, sont positives pour le test de l’oxydase. La plupart des espèces fermentent le glucose, sans production de gaz. A l’exception des espèces V. cholerae et V. mimicus qui sont halotolérantes, les espèces de Vibrio sont halophiles et requièrent du sodium pour leur croissance (Cohen et Karib, 2007). En effet, les besoins en NaCl dans le milieu varient selon les espèces (5-15 mM pour V. cholerae, 140-260 mM pour V. vulinficus et V. parahaemolyticus) (China et al., 2003). Les Vibrio se développent abondamment en milieux peptonés simples et généralement sur le milieu "marine agar" et sur la gélose Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose (TCBS) (Cohen et Karib, 2007). La densité des espèces de Vibrio dans l’environnent marin évolue en fonction de divers facteurs climatiques et environnementaux, tels que la température de surface de l’eau, la salinité, la turbidité, le pH et la présence de chlorophylle A (Quilici et Robert- Pillot, 2011). La tolérance des vibrions à la température varie d’une espèce à l’autre, mais les plus hautes densités de vibrions sont retrouvées dans des eaux à des températures comprises entre 20 °C et 30 °C (Tantillo et al., 2004). A des basses températures, les vibrions survivent dans les sédiments sans être cultivables mais lorsque la température augmente au-delà de 15-20 °C, ces bactéries se multiplient et sont décelables dans l’eau et dans les produits de mer (mollusques, poissons, crustacés) (Strom et Paranjpye, 2000). La distribution des espèces de Vibrio est influencée par la salinité qui peut être perturbée par la fréquence des pluies, des tempêtes et des ouragans induits par le changement climatique (Donnelly et Woodruff, 2007). Dans l’eau de mer, les variations d’abondance des Vibrio s’expliquent par la salinité et la concentration en matières organiques, alors que dans les sédiments, la température de surface de l’eau est le seul facteur qui affecte de manière significative leur abondance (Vezzulli et al., 2009). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 24 Le nombre d’espèces décrites ne cesse de croître passant de 20 espèces identifiées en 2002, à 90 espèces en 2011 (Quilici et Robert-Pillot, 2011). La plupart des espèces de Vibrio ne sont pas pathogènes pour l’homme et l’on considère qu’elles fournissent un large réservoir de gènes virulents connus. La mobilité des gènes de virulence et leur capacité de transfert permet la transformation de souches non pathogènes en souches pathogènes (Faruque et Nair 2002). Sur les 90 espèces que comprend le genre Vibrio, 12 sont considérées comme pathogènes pour l’homme. Les quatre espèces les plus fréquemment isolées dans les laboratoires de microbiologie clinique sont V. cholerae non-O1/non-O139, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. alginolyticus (Quilici et Robert-Pillot, 2011). Trois autres espèces sont rarement isolées : V. fluvialis, V. hollisae et V. mimicus. Le caractère pathogène des cinq autres espèces, V. carchariae, V. cincinnatiensis, V. damselae, V. furnissii et V. metschnikovii, n’est pas clairement établi (Fournier et Quilici, 2002). Cependant, les principales espèces pathogènes associées aux fruits de mer sont : V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus (China et al., 2003). Les espèces de Vibrio pathogènes pour l’homme sont résumées dans le tableau II. Tableau II: Espèces de Vibrio potentiellement pathogènes pour l’homme (Quilici et Robert-Pillot, 2011). Le génome des espèces de Vibrio est constitué de deux chromosomes circulaires dont celui de plus grande taille (environ 3 mégabases) porte la plupart des gènes Espèces fréquemment isolées - Vibrio cholerae - Vibrio parahaemolyticus - Vibrio vulnificus - Vibrio alginolyticus Espèces rarement isolées - Vibrio fluvialis - Vibrio hollisae - Vibrio mimicus Espèces à pathogénicité douteuse - Vibrio carchariae - Vibrio cincinnatiensis - Vibrio damselae - Vibrio furnissii - Vibrio metschnikovii THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 25 indispensables à la croissance bactérienne et à l’expression du pouvoir pathogène et l’autre de petite taille (de 1,1 à 1,9 mégabases) porte des gènes permettant aux bactéries de s’adapter au milieu extérieur (Quilici et Robert-Pillot, 2011). On distingue les “vibrions cholériques”, qui comprennent les souches appartenant aux sérogroupes O1 et O139 de l’espèce V. cholerae, et les “vibrions non cholériques” qui comprennent d’une part, les souches de V. cholerae des sérogroupes autres que O1 et O139 (plus de 200 sérogroupes décrits) appelées V. cholerae non-O1/non-O139, et d’autre part, les souches des autres espèces du genre Vibrio (Cohen et al., 2007). Les vibrions sont facilement détruits par la chaleur. Une cuisson suffisamment prolongée suffit à éliminer la plupart des vibrions. Toutefois, Blake et al. (1980) ont constaté que des V. cholerae 01 survivaient jusqu'à 8 min à l'ébullition et jusqu'à 25 min à l'étuvage dans des crabes naturellement contaminés. Aussi, une étude menée dans des restaurants de la Nouvelle-Orléans aux États-Unis a -t-elle permis de retrouver V. parahaemolyticus dans 50 % des échantillons d’huîtres cuites, 67 % des échantillons de crevettes bouillies et 33 % des échantillons de salades de crabe (FDA, 2005). En effet, la vitesse avec laquelle les micro-organismes sont tués par la chaleur dépend de la température, de l'humidité, du type de micro-organismes et du milieu dans lequel se trouvent ces derniers pendant le traitement thermique. Si les micro-organismes sont piégés dans des tartres ou autres substances, ils sont protégés et par conséquent la chaleur, même élevée, risque d'être inefficace pour les tuer. Il importe de se rappeler la cinétique de l'inactivation des micro-organismes par la chaleur : Formule (1) Où : C est la population originelle de micro-organismes vivants (numération initiale des organismes viables) Ct est le nombre total des survivants au bout du temps t. K, le taux de létalité, est une constante (pente de la droite) qui dépend du micro-organisme dont il s'agit et des conditions d'expérience. Le nombre des micro-organismes survivants au temps “t” est fonction du niveau d'infection initiale, ainsi que de la constante taux de mortalité et du temps de chauffage (Huss, 1996). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 26 1.2. Pouvoir pathogène et toxinogène des bactéries impliquées dans le choléra et les infections à vibrions non cholériques I.2.1. V. cholerae O1 et O139 Les souches de V. cholerae O1 et O139 toxinogènes isolées chez l'homme sont responsables d'épidémies de choléra. L’ingestion de 108 à 1011 bactéries en solution aqueuse est nécessaire, chez un individu sain, pour provoquer la maladie. L’inoculum peut être moins important, de 103 à 106 germes, si l’acidité gastrique est faible, notamment en cas de malnutrition, ou si les vibrions sont absorbés avec des aliments qui les protègent de l’acidité gastrique (Kaur et Ganguly, 2003). Après passage dans l’estomac, les vibrions qui ont survécu se multiplient dans la lumière de l’intestin grêle et adhèrent à l’épithélium. Ils sécrètent la toxine cholérique (CT) qui est une entérotoxine responsable d’une importante diarrhée liquide qui peut entraîner la mort (Reidl et Klose, 2002). Les vibrions cholériques produisent, comme principaux facteurs de pathogénicité, la toxine cholérique (CT) et le facteur d’adhésion TCP (Toxin-Coregulated Pilus). La toxine cholérique CT est une exotoxine codée par le phage filamenteux CTXΦ, intégré au chromosome I de V. cholerae (Lencer et Tsai, 2003). On distingue deux parties dans CTXΦ (Faruque et Mekalanos, 2003): la région RS2 (codant pour des protéines impliquées dans l’intégration, la réplication et la régulation de CTXΦ) et la partie centrale ou core, qui porte les gènes ctxA et ctxB, ainsi que d’autres gènes codant notamment pour des protéines structurales du phage. L’expression du phage CTXΦ est induite par l’ensoleillement et sa stabilité dépend de la température (moins de 37 °C), de la salinité (au-delà de 0,5 %) et du pH (intervalle de 5 à 10) (Faruque et al., 2000). Le TCP est un facteur de virulence clé dans le processus infectieux de V. cholerae. Le TCP est un pilus de type IV, indispensable à la colonisation du tractus intestinal de l’homme (Herrington et al., 1988) et est le récepteur au bactériophage filamenteux CTXΦ, codant pour la toxine cholérique chez V. cholerae (Heidelberg et al., 2000). La biosynthèse du TCP requiert l’activité de quinze gènes regroupés dans l’opéron TCP, localisés sur le chromosome I. Cet opéron fait partie intégrante d’un ilot de pathogenicité appelé VPI (39,5 kpb) caractéristique des souches de V. cholerae à l’origine d’épidémies et de pandémies. L’acquisition du facteur TCP et de la toxine CT est séquentielle: d'abord la bactérie V. cholerae isolée acquière le facteur TCP et puis elle acquière la toxine CT par l'intermédiaire de CTXΦ (Waldor et Mekalanos, 1996). Le pouvoir pathogène des vibrions cholériques est lié à la présence des gènes ctxA et ctxB qui codent pour les sous-unités A et B de la toxine cholérique. Outre ces gènes ctxA THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 27 et ctxB, les gènes zot et ace sont également impliqués dans le pouvoir pathogène, en codant pour des protéines qui agissent en augmentant la perméabilité de la muqueuse intestinale. Les gènes zot et ace sont encadrés de séquences RS1 codant pour un élément transposable porté par un prophage (Faruque et Nair, 2002 ; Sack et al., 2004). La régulation de la virulence implique de multiples systèmes dont le plus important est le régulon toxR : la protéine ToxR se fixe en amont des gènes ctxAB pour augmenter leur transcription et contrôle l’expression d’au moins 17 autres gènes, en fonction de stimuli environnementaux (température, pH, osmolarité). De plus, le gène toxR active l’expression des gènes tcp essentiels pour l’adhésion de V. cholerae aux entérocytes (Reidl et Klose, 2002). 1.2.2. Vibrio cholerae non O1 et non O139 A la différence de ce qui se passe pour le choléra, il n’y a pas de transmission interhumaine des infections à Vibrio cholerae non-O1/non-O139. Les souches de V. cholerae non-O1/non-O139 ont pour réservoir l’environnement hydrique. A la suite d’un contact de l’homme avec les eaux côtières ou estuariennes ou après ingestion de produits de mer, les souches de V. cholerae non-O1/non-O139 sont responsables d’infections cutanées et d’infections par voie digestive, lors de toxi-infections alimentaires isolées ou collectives (Feldhusen, 2000). Des facteurs de virulence ont été associés aux infections à Vibrio cholerae non- O1/non-O139 dont le pouvoir pathogène s’exprime par des mécanismes clairement distincts de ceux des vibrions cholériques. Il a été décrit dans des zones d’endémie ou d’épidémie cholériques, de rares souches de V. cholerae non-O1/non-O139 possédant les gènes des facteurs de virulence majeurs habituellement associés aux vibrions cholériques, la toxine cholérique, le facteur d’adhésion TCP, le régulon Tox R permettant l’expression de CT et TCP (Quilici et Robert-Pillot, 2011). Une minorité de souches de V. cholerae non-O1/non-O139 produisent également une toxine thermostable (ST) (Cohen et al., 2007). Des facteurs cytotoxiques, des enzymes exocellulaires, plusieurs systèmes de colonisation ont été décrits aussi bien chez des souches isolées de cas cliniques que de l’environnement (Zhang et Austin, 2005 ; Chen et al., 2007). Une hémolysine El Tor-like provoquant une augmentation de la perméabilité vasculaire, pourrait contribuer à la capacité de certains isolats à envahir la circulation sanguine chez les immunodéprimés (Zhang et Austin, 2005 ; Saka et al., 2008). En effet, chez des sujets immunodéprimés ou présentant des pathologies sous-jacentes, les infections à V. cholerae non-O1/non-O139 peuvent évoluer vers une septicémie dans 5 % des cas, avec un taux de mortalité de 1 à 4 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 28 %, principalement chez les patients développant une septicémie (Butt et al., 2004). Environ 70 % des souches V. cholerae non-O1/non-O139 possèdent une capsule polysaccharidique, constituée entièrement de sucres qui augmente la capacité des bactéries à résister à la phagocytose et à provoquer des septicémies chez les sujets immunodéprimés (Zhang et Austin, 2005 ; Cohen et al., 2007 ; Saka et al., 2008). 1.2.3. Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus, du fait de son caractère halophile, est une bactérie naturellement présente dans la mer et les eaux saumâtres. Cette bactérie est souvent transmise à l’homme par la consommation de crevettes ou de crabes insuffisamment cuits ou recontaminés après cuisson, et d’huitres crues (Quilici et Robert-Pillot, 2011). Des études réalisées aux États-Unis révèlent la présence de V. parahaemolyticus dans les huîtres au niveau du détail ainsi que sur les marchés de vente en gros (Cook et al., 2002). Cette étude révèle que, même si les niveaux sont inférieurs à 100 micro- organismes/g dans la majorité des lots testés, ils peuvent dépasser les 10 000 micro- organismes/g dans certaines régions du globe. À la fin des années 1960 et au début des années 1970, V. parahaemolyticus a été reconnue comme une cause de maladie diarrhéique dans le monde. Le pouvoir pathogène de cette bactérie est lié à la présence de deux hémolysines, une hémolysine thermostable directe (thermostable direct hemolysin ou TDH) et une hémolysine apparentée à l’hémolysine thermostable directe (tdh-related hemolysin ou TRH) (Zhang et Austin, 2005). Selon la littérature, pratiquement tous les isolats de V. parahaemolyticus associés à une gastro-entérite produisent l’une ou l’autre de ces deux hémolysines (Matsumoto et al., 2000). Deux autres composants hémolytiques ont été identifiés chez V. parahaemolyticus, une phospholipase A et une lysophospholipase, mais leur rôle exact n’est pas connu et aucune relation entre leur production et le pouvoir pathogène des souches de V. parahaemolyticus n’a été établie (Quilici et Robert-Pillot, 2011). Des souches de V. parahaemolyticus d’origine clinique ne possédant ni le gène tdh ni le gène trh, produisant une protéase ayant une activité sur la croissance cellulaire et provoquant des hémorragies dans les tissus peuvent être létales pour une souris après injection par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (Lee et al., 2002). Vibrio parahaemolyticus possède deux systèmes de sécrétion de type III (T3SS1 et T3SS2), respectivement présents sur les chromosomes 1 et 2 et qui jouent un rôle de cytotoxité, d’entérotoxicité et de pouvoir septicémique par le biais d’effecteurs protéiques (Hiyoshi et al., 2010). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 29 Les facteurs de pathogénicité sont rarement mis en évidence dans les souches isolées de l’environnement marin ou des produits de la mer. Selon les études réalisées, seulement 1 à 5% des isolats possèdent le gène trh et un travail initié dans l’estuaire de la Gironde a montré que la proportion de ces souches pouvait atteindre jusqu’à 15% (Robert-Pillot et al. 2004). Il subsiste une grande incertitude quant aux doses infectieuses, et on reconnaît généralement que chaque personne est susceptible d’être infectée par V. parahaemolyticus, lorsque ce microorganisme est présent en concentration suffisante. Une étude publiée en 2005 par la Food and Drug Administration (FDA) aux Etats-Unis fait état d’une dose infectieuse de 106 Vibrio parahaemolyticus pour initier une infection chez des volontaires par voie alimentaire (FDA, 2005). 1.2.4. Vibrio vulnificus La bactérie Vibrio vulnificus est considérée comme l’un des agents pathogènes d’origine hydrique les plus dangereux pour la santé humaine, avec un taux de létalité supérieur à 50% pour les formes septicémiques. Les voies de contamination de Vibrio vulnificus sont généralement cutanées mais la voie alimentaire a été aussi décrite (Quilici et Robert-Pillot, 2011). Aux Etats-unis, la contamination par voie digestive associée à la consommation d’huîtres crues semble être majoritaire et les infections suite à l’exposition de plaies à l’eau de mer représente 25% à 45% selon les études (Bross et al., 2007). Au Japon, les deux voies de contamination sont décrites et les crevettes ont été incriminées dans la voie alimentaire (Inoue et al., 2008). En Europe, la contamination est exclusivement par voie cutanée (Frank et al., 2006). Diverses techniques de typage moléculaire ont permis de diviser l’espèce Vibrio vulnificus en trois biotypes sur la base de caractères biochimiques. Les souches virulentes pour l’homme appartiendraient majoritairement aux biotypes 1 et 3 alors que le biotype 2 est pathogène pour le poisson (Jones et Olivier, 2009). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 30 1.2.5. Vibrio alginolyticus Vibrio alginolyticus est l’espèce la plus fréquemment isolée des écosystèmes marins tempérés ou tropicaux (Hervio-Heath et al., 2002). Les cas de gastroentérites liés à V. alginolyticus sont exceptionnels (Fournier et Quilici, 2002). Les infections à V. alginolyticus sont principalement des otites, des conjonctivites, des pyodermites superficielles et consécutives à un contact direct avec le milieu marin (Sganga et al., 2009). Des facteurs de virulence tels que des protéases, une collagénase et des protéines de la membrane externe responsable de l’adhésion de Vibrio alginolyticus aux cellules contribuent à sa pathogénicité (Qian et al., 2008). Gonzalez-Escalona et al. (2006) ont isolé des huîtres, une souche de Vibrio alginolyticus porteuse d’un gène trh codant pour une hémolysine présentant 98% d’homologie avec le gène trh de Vibrio parahaemolyticus. Vibrio alginolyticus serait un réservoir de gènes de virulence dans l’environnement aquatique pour d’autres espèces de Vibrio, particulièrement V. cholerae et V. parahaemolyticus (Xie et al., 2005). 1.2.6. Vibrio mimicus Vibrio mimicus et Vibrio cholerae partagent près de 100% de similitude au niveau du gène 16S ARNr et montrent autour de 80% ADN-ADN de parenté, ce qui rend la discrimination entre ces espèces difficile pour les taxonomistes et les cliniciens (Thompson et al., 2003). Cependant l’analyse de séquences génomiques multiples permet de mieux différencier ces deux espèces (Thompson et al., 2008). Elles peuvent également partager d’importants facteurs de virulence, tels que les gènes ct et tcp (O'Shea et al., 2004). Plusieurs espèces de V. mimicus isolées de source clinique et environnementale ont montré la production de toxines telles qu’une hémolysine, la zonula occludens toxine et une entérotoxine (Campos et al., 1996). La consommation de crustacés contaminés par V. mimicus peut entrainer une gastro- entérite (Acuna et al., 1999) et cette bactérie a été associée à de petites épidémies ou des cas isolés de diarrhée (Campos et al., 1996). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 31 2. Paragonimose 2.1. Définition La paragonimose ou distomatose pulmonaire est une anthropozoonose parasitaire due au développement chez les carnivores d’un digène appartenant au genre Paragonimus (Keiser et Utzinger, 2009). Cette parasitose est causée par la consommation de crabes ou écrevisses crus ou mal cuits infestés par des métacercaires de Paragonimus (Jeon et al., 2005). Elle peut être aussi causée par la consommation de la viande crue ou insuffisamment cuite d’hôte paraténique comme le sanglier infestée par Paragonimus (Nakamura-Uchiyama et al., 2002). 2.2. Agents pathogènes 2.2.1. Position systématique Les douves appartiennent au phylum des Platyhelminthes, à la classe des Trematoda, à la sous-classe des digenea, à l’ordre des Plagiorchiida, à la famille des Troglotrematidae et au genre Paragonimus (Keiser et Utzinger, 2009). 2.2.2. Genre Paragonimus Il comprend plus de 50 espèces réparties sur les continents africain, asiatique et américain et environ 15 espèces parmi elles sont pathogènes pour l’homme (Blair et al., 1999;Tandon et al., 2007 ). En Asie, les espèces telles que P. skrjabini, P. heterotremus, P. miyazakii, P. huerlungensis, P. westermani et P. philippinensis ont été incriminées dans des cas de paragonimose. En Amérique, diverses espèces y compris P. mexicanus, P. ecuadoriensis et P. kellicotti, ont infecté l’homme en Amérique du Sud et Centrale et particulièrement en Colombie, au Mexique, en Équateur et au Pérou (Velez et al., 2000 ; Cornejo et al., 2000 ; Paugam, 2008). En Afrique, les principales espèces de Paragonimus sont P. africanus et P. uterobilateralis (Moyou-somo et al., 2003). En Côte d’Ivoire, d’après Nozais et al. (1996), P. africanus serait présent dans la ville de Lakota et P. uterobilateralis dans le sud-ouest du pays. Cependant selon Blair et al. (1999), ces résultats ne sont basés que sur des tentatives d’identification portant sur la mesure des œufs éliminés dans les selles ou les expectorations des malades. 2.2.3. Morphologie Paragonimus est un trématode hermaphrodite qui ressemble à un grain de café. La plus étudiée des espèces de Paragonimus qui est Paragonimus westermani peut être sous THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 32 forme diploïde, triploïde ou tétraploïde (Agatsuma et Hirai, 2005 ; Blair et al., 2007). Les espèces de Paragonimus peuvent être différenciées par des critères distinctifs grâce à l’assemblage des caractères suivants: - la forme générale du corps - la taille et la disposition des épines - la forme et le volume des testicules et des ovaires - le rapport du diamètre des ventouses orale et ventrale - la forme et la dimension des œufs (Guillermain, 1981 ; Doanh et al., 2007 ; Blair et al., 2007). La figure 12 montre un ver juvénile (a) et deux vers adultes (b et c) de Paragonimus sp. En Côte d’Ivoire, d’après Nozais et al. (1996), deux espèces, P. africanus et P. uterobilateralis serait présentes, c’est la raison pour laquelle nous limiterons notre description à ces deux espèces. 2.2.3.1. Paragonimus africanus Il a un aspect en grain de café et une couleur brun rosé. La longueur de l’adulte est de 16 à 17 mm pour 10 mm de large. La ventouse antérieure est plus grande que la ventouse ventrale, laquelle est située aux deux tiers antérieurs du corps. Des épines tégumentaires existent entre les ventouses. L’ovaire est localisé le plus souvent dans la partie droite du parasite et se divise en cinq branches épaisses et ramifiées. Les deux testicules sont largement étalés et se situent de part et d’autre de la vésicule excrétrice (Voelker et Vogel, 1965). La figure 13 montre le schéma de l’anatomie de P. africanus. 2.2.3.2. Paragonimus uterobilateralis Il est nettement plus petit que P. africanus car il mesure 6,3 mm de long pour 3,5 mm de large. Les ventouses sont de tailles sensiblement égales. Les épines tégumentaires sont réparties sur l’ensemble du corps. L’appareil génital mâle ressemble à celui de P. africanus. Par contre, l’appareil femelle est différent car l’utérus est souvent bilatéral, d’où le nom donné à cette espèce. L’ovaire est irrégulièrement ramifié, plus grêle, digitiforme et étiré en longueur (Voelker et Vogel, 1965). D’après Ripert (1996), les deux espèces précitées peuvent aussi être reconnues sur l’aspect des métacercaires: une seule membrane pour P. uterobilateralis et deux membranes pour P. africanus. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 33 a b c Figure 12: Paragonimus sp Source : Velez et al., 2003 Figure 13: Anatomie de Paragonimus africanus (face ventrale) H : Testicules, 0 : Ovaires Source : Miyazaki, 1991 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 34 2.2.4. Œufs et stades larvaires de Paragonimus 2.2.4.1. Œufs de Paragonimus sp. Les œufs de Paragonimus sont de grande taille, ovoïdes, avec un opercule net et aplati, non embryonnés à la ponte et ils contiennent chacun un ovule fécondé entouré d’un amas de cellules nourricières. Ces œufs peuvent mesurer de 80 µm à 100 µm de long. La taille des œufs, comme celle des adultes, est proportionnelle à la ploïdie du parasite. Le développement de l'œuf dure environ trois semaines à 37°C. La coque est lisse, transparente et plus épaissie au pôle opposé à l’opercule. La couleur des œufs varie selon les auteurs : jaune d’or pour Bossé (1984), brunâtre pour Nozais et al. (1996). La figure 14 montre un œuf de Paragonimus sp. 2.2.4.2. Miracidium Le miracidium est ovale et sa surface est recouverte de nombreux longs cils (Velez et al., 2003). C’est en fait une larve ciliée libérée de l’éclosion de l’œuf de Paragonimus qui après sa pénétration dans le premier hôte intermédiaire de Paragonimus (mollusque), se transforme en sporocyste qui formera une rédie mère, laquelle va produire à son tour des rédies filles et des cercaires (Collet et al., 2012). La figure 15 montre un miracidium de Paragonimus sp. 2.2.4.3. Cercaires Les cercaires sont des formes aquatiques libres du parasite. On retrouve les cercaires de Paragonimus chez les premiers hôtes intermédiaires (mollusques). On a pu observer l’infestation naturelle par des cercaires microcerques comme les cercaires de Paragonimus spp. au Cameroun (Moyou-somo et Simo, 1995). Kruidener en 1953, décrivit à partir de la cercaire de P. kellicotti, six paires de glandes mucoïdes disposées parallèlement à l’axe médian de développement de la cercaire. Le corps des cercaires est recouvert de petites épines dont les plus grandes font 4 µm de long et dont la disposition peut servir à la différenciation de l’espèce (Guillermain, 1981). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 35 Figure 14: Œuf de Paragonimus sp. Source : Strobel et Tran, 2004 Figure 15: Miracidium de Paragonimus sp. Source: Velez et al., 2003 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 36 2.2.4.4. Métacercaires Les métacercaires de Paragonimus sont de petits kystes sphériques que l’on rencontre le plus souvent dans les muscles des crabes (Aka et al., 1999). La métacercaire mature enkystée est globulaire, entourée d’une paroi kystique consistant en une mince membrane externe et une membrane interne épaisse. A l’intérieur, on retrouve le tube digestif, latéralement replié sur lui-même et de larges vésicules excrétoires médianes remplies de granules réfractaires. Les métacercaires servent à la différenciation de l’espèce par leur taille, leur paroi et leur pigment intérieur qui leur confère une certaine couleur (Doanh et al., 2007). Dans le crustacé, les métacercaires enkystées dans une paroi épaisse sont ainsi protégées des différences de température. Pour tuer l’ensemble des métacercaires dans un crabe, il faut au moins 10 minutes de cuisson à 55°C ou une réfrigération pendant deux jours à moins de 10° C (Guillermain, 1981). Les charges en métacercaires dans chaque crabe sont variables. Il peut y avoir plus de 50 métacercaires dans un individu, si bien que Sachs et Cumberlidge (1991 b) ont défini trois types d’intensité : faible (<10 kystes par crabe), moyenne (de 10 à 50 kystes par crabe) et élevée (> 50 kystes par crabe). La figure 16 montre une métacercaire de P. africanusLe tableau III précise les caractéristiques des métacercaires chez les deux espèces de Paragonimus rencontrées en Afrique (Miyazaki, 1991): Tableau III: Caractéristiques des métacercaires chez Paragonimus africanus et Paragonimus uterobilateralis Espèces Diamètre moyen en µm (limites) Nombre d’enveloppes P. africanus 416 à 449 2 (1 externe épaisse ; 1 interne mince) P. uterobilateralis 702 (493 à 924) 1 (très mince) 2.2.5 Cycle biologique de Paragonimus Le parasite de la paragonimose, quelle que soit l’espèce, obéit à un cycle trihétéroxène avec un hôte définitif (un mammifère) et deux hôtes intermédiaires représentés par un mollusque et un crustacé d’eau douce (Keiser et Utzinger, 2009). Chez l’hôte définitif qui peut être l’homme ou un carnivore, les parasites adultes sont localisés dans les sacs pulmonaires et pondent des œufs qui sont éliminés dans les bronches. Là, deux voies s’offrent pour leur élimination : soit ils sont évacués dans le milieu extérieur avec les THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 37 expectorations, soit ils sont avalés, passent dans le tube digestif et sont éliminés avec les selles (Blair et al., 2007). Dans le milieu extérieur, l’œuf va poursuivre son développement au cours d’une période d’incubation. La durée de celle-ci dépend de la température et de l’humidité qui règnent sur le terrain (Ripert, 1996). L’œuf va alors éclore en libérant une larve ciliée : le miracidium qui nage dans le milieu extérieur à la recherche d’un mollusque hôte. Après sa pénétration dans le mollusque (gastéropode) aquatique, le miracidium se transforme en sporocyste. Celui-ci forme une rédie mère, laquelle va produire à son tour des rédies filles et des cercaires (Collet et al., 2012). Ce sont ces dernières qui sortent du mollusque. Les cercaires migrent vers des crustacés d’eau douce tels que les crabes et les écrevisses pour s’enkyster en général dans leurs muscles ou leurs branchies et se transformer en métacercaires (Blair et al., 2007). La contamination de l’hôte définitif par le parasite se fait lors de la consommation de crustacés mal cuits ou encore de façon accidentelle par l’ingestion de fragments de crustacés lors des préparations culinaires. Les métacercaires se désenkystent dans le duodénum, traversent la muqueuse duodénale et migrent vers le diaphragme pour gagner les poumons du mammifère à 2 à 6 semaines après leur ingestion (Nawa et al., 2005 ; Paugam, 2008). Dans les poumons, les adultes qui peuvent vivre entre 6 et 20 ans peuvent pondent plus de 10 000 œufs par jour (Strobel et Tran, 2004). Les adultes sont généralement par paires dans les poumons et sont encapsulés dans une réaction fibreuse de l’organisme (Blair et al., 2007) et durant tout le temps, ils doivent obtenir les nutriments de l’hôte (Choi et al., 2006). La figure 17 décrit le cycle biologique de Paragonimus. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 38 2.3. Hôtes intermédiaires de Paragonimus sp. 2.3.1. Gastéropodes En Afrique, peu d’informations sont disponibles sur le premier hôte intermédiaire de Paragonimus sp. Deux Gastéropodes Prosobranches ont été incriminés dans le cycle biologique de la paragonimose. Le premier, Potadoma freethii (escargot appartenant à la famille des Thiaridae) a été infesté par Paragonimus sp. au Cameroun (Asor et al., 2003). Au Nigéria une autre espèce d’escargot, Melania sp. contenait des sporocystes attribués à Paragonimus sp. (Arene et al., 1998). Deux mollusques terrestres ont été infestés naturellement par des cercaires microcerques comme les cercaires de Paragonimus spp. Le premier est Homorus striatella au Libéria (Sachs et Cumberlidge, 1991 a) tandis que le second est Achatina sp au Cameroun (Voelker et Sachs, 1977). 2.3.2. Crustacés Il est admis depuis longtemps que les crustacés tels que les crabes sont responsables de la contamination humaine de la paragonimose (Brumpt, 1949). En Asie, des métacercaires de Paragonimus westermani et de Paragonimus miyazakii ont été trouvées dans les crabes d’eau douce appartenant à l’espèce Geothelphusa dehaani au Japon (Sugiyama et al., 2009) et des métacercaires de Paragonimus heterotremus ont été trouvées dans les crabes de montagne appartenant à l’espèce Potamiscus tannanti au Vietnam (Doanh et al., 2007). Les principales espèces de crabes hôtes intermédiaires de Paragonimus sp. répertoriées en Afrique par Blair et al. (1999) et Aka et al. (2008 c) sont Sudanonautes africanus (Nigeria et Cameroun), S. granulatus (Cameroun), S. aubryi, S. floweri (Nigeria) Liberonautes chaperi, L. latidactylus, L. nanoides, L. paludicolis (Liberia) et Callinectes marginatus (Bénin, Côte d’Ivoire). En effet, Moyou-Somo et al. (2003) ont trouvé un taux d’infestation des crabes de 6 % au Cameroun et Arene et al. (1999) ont trouvé un taux d’infestation des crabes de 2,4 % au Nigéria. Au Bénin, Aka et al. (1999) ont trouvé une prévalence de 5 % chez le crabe de lagune Callinectes marginatus et une prévalence de 20 % a été trouvée par Aka et al. (2009) en Côte d’Ivoire chez le crabe Callinectes marginatus. 2.4. Hôtes définitifs de Paragonimus sp. En dehors de l’homme, un certain nombre de mammifères sauvages peuvent présenter une infestation naturelle avec P. africanus ou P. uterobilateralis. En effet, plusieurs espèces comme la civette, la mangouste, le chien ou le mandrille peuvent être porteurs THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 39 d’une infestation naturelle avec Paragonimus sp. D’autres mammifères ont été parasités avec l’un ou l’autre de ces digènes lorsque des infestations expérimentales ont été pratiquées. C’est le cas de Cerocebus sp (singe), de Cercopithecus aethiops (singe), de Macaca mulatta (Primates) pour P. africanus. Pour l’autre douve, citons le chat, le chien et des muridés comme le rat et la souris (Blair et al., 1999 ; Blair et al., 2007). Le tableau IV répertorie les principales espèces de Paragonimus qui ont affectées l’homme sur les continents asiatique, africain et américain avec leurs hôtes définitifs. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 40 Figure 16: Métacercaire de Paragonimus africanus Source : Photographie prise par Traoré Sylvain en 2010 Figure 17 : Cycle de Paragonimus sp. Source: Veasna, 2005 THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 41 Tableau IV: Distribution géographique et hôtes définitifs d’espèces de Paragonimus (Blair et al., 2007). Espèces Distribution géographique Hôtes définitifs P. westermani P. skrjabini P. heterotremus P. africanus P. uterobilateralis P. kellicotti P. mexicanus Chine, Corée, Japon, Taiwan, Philippines, Malaisie, Thaïlande, Laos, Vietnam, Cambodge, Inde, Sri Lanka, Népal, Pakistan Chine, Japon, Thaïlande, Inde Chine, Vietnam, Laos, Thaïlande, Inde Guinée équatoriale, Cameroun, Nigeria, Côte d’Ivoire Cameroun, Nigeria, Libéria, Gabon Mississipi, Québec, Ontario Mexique, Panama, Pérou, Costa Rica, Guatemala Cercopithécidés (primates), Canidés (chien), Félidés (félins), Herpestidae (Mangouste), Viverridés (Civettes), Mustélidés (Loutre, Blaireau), Muridés (rongeurs). Canidés (chien), Félidés (félins), Herpestidae (Mangouste), Viverridés (Civettes), Mustélidés (Loutre, Blaireau), Muridés (rongeurs) Félidés (félins), Sciuridés (écureuil), Muridés (rongeurs) Cercopithécidés (primates), Herpestidae (Mangouste), Viverridés (Civettes), Loridae (primates) Canidés (chien), Herpestidae (Mangouste), Viverridés (Civettes), Mustélidés (Loutre, Blaireau) Didelphidés (Marsupiaux), Canidés (chien), Félidés (félins), Mustélidés (Loutre, Blaireau), Procyonidés (Raton laveur), Suidés (Porcins), Bovidés (bovins, ovins), Muridés (rongeurs) Didelphidés (Marsupiaux), Canidés (chien), Félidés (félins), Cebidés (singes), Mustélidés (Loutre, Blaireau), Procyonidés (Raton laveur), Suidés (Porcins) THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 42 2.5. Distribution géographique de la paragonimose humaime La paragonimose est peu connue en raison d’une distribution en foyers, bien que l’on estime à 290 millions le nombre de personnes à risque et à 21 millions le nombre de sujets touchés dans le monde (Keiser et Utzinger, 2005). Cette maladie qui sévit essentiellement en zone tropicale, se distribue principalement sur trois continents : l’Asie du sud-est, l’Afrique et l’Amérique du sud, mais la plus plupart des cas de paragonimose ont été observés sur le continent asiatique (Aka et al., 2008 c). En effet, en Asie, des pays tels que le Japon, la Thaïlande, les philippines, la Corée, la Chine et le Vietnam se partagent la grande majorité des patients. En dehors du continent asiatique, des cas ont été signalés en Amérique latine, où les populations ont des habitudes de consommation de crabes et d’écrivisses crus ou insuffisamment cuits (Nakamura-Uchiyama et al., 2002 ; Moyou-Somo et al., 2003). La figure montre la carte de la distribution géographique de la paragonimose dans le monde. En Afrique, des foyers épidémiques ont été rapportés dans une dizaine de pays (2295 cas), principalement autour du Golf de Guinée et en Afrique centrale, mais deux états ont été particulièrement touchés, à savoir le Nigeria (1778 cas) et le Cameroun (454 cas). En Côte d’Ivoire, le premier cas fut découvert en 1974 et 16 cas ont été rapportés dans la littérature (Aka et al., 2008 c). La figure 19 montre la carte de la distribution géographique de la paragonimose en Afrique, où des cas humains de paragonimose ont été rencontrés dans 11 pays en orange sur la carte. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 43 Figure 18: Carte de la distribution géographique de la paragonimose dans le monde Source: Strobel et Tran, 2004 Figure 19 : Localisation géographique des pays africains dans lesquels des cas de paragonimose ont été détectés Source : Aka et al., 2008 c THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 44 2.6. Manifestations cliniques La paragonimose est généralement méconnue du public, des personnels de santé, et des médecins. Elle est souvent confondue avec la tuberculose et le cancer du poumon (Jeon et al., 2005), ce qui fait que même en zone d’endémie, le diagnostic de la paragonimose humaine n’est pas aisé. En effet, c’est souvent tardivement que les médecins évoquent l’éventualité de cette maladie (Strobel et al., 2005). Au Nigéria et au Cameroun des cas de co-existences entre la paragonimose et la tuberculose ont été rapportés (Nkouawa et al., 2009). La phase de migration et d’invasion du parasite de la paragonimose est caractérisée par une fièvre, une diarrhée, des douleurs abdominales, une toux (Moyou-Somo et al., 2003). Les symptômes caractéristiques d’une localisation pulmonaire du parasite sont la toux chronique, l’hémoptysie (intermittentes), des douleurs thoraciques et des lésions pulmonaires visibles sur radiographie pulmonaire (Moyou-Somo et Tagni-Zukam, 2003). Du fait de la complexité des voies de migration du parasite chez l’hôte définitif, des cas de localisation extrapulmonaire (cutanée et cérébrale) du parasite ont été observés (Nawa et al., 2005). 2.7. Facteurs de risque de la paragonimose humaine L’endémicité de la paragonimose est la résultante de plusieurs facteurs socio- culturels, écologiques, environnementaux et socio-politiques. Elle persiste dans les zones pauvres et reculées et chez les minorités ethniques (Inde, Chine méridionale, nord Vietnam, Laos) (Tran et al., 2004). 2.7.1. Facteurs socio-culturels 2.7.1.1. Habitudes alimentaires La paragonimose est étroitement associée aux activités culturelles de l’homme en relation avec son alimentation et la préparation de ses aliments (Blair et al., 2007). Dans les pays asiatiques, la paragonimose est endémique spécifiquement en Chine, Japon, Corée, Thaïlande où les populations aiment consommer des crabes d’eau douce crus ou insuffisamment cuits (OMS/FAO, 2004). En effet, certains mets locaux jouent un rôle prépondérant dans la contamination. A titre d’exemple, nous pouvons citer les mets tels que le Ke-jang (crabe à la sauce de soja), le crabe en saumure ou macéré au vin de Chine, le Kinilow (crabes ou poissons crus), le Sinigang et le Pla-poo à base de crabe en Thaïlande (Ndozi, 2000). La paragonimose touche de plus en plus les grandes métropoles. En effet, l’habitude de manger cru se modifie: les populations rurales pauvres qui y étaient traditionnellement attachées l’abandonnent peu à peu, alors qu’à l’inverse, dans les villes THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 45 japonaises, et auprès des couches aisées, cette habitude est en train d’émerger comme un phénomène de mode (Nakamura-Uchiyama et al., 2002). Dans certaines régions, la maladie touche surtout les enfants en raison de leur plus grande exposition. Ils chassent et consomment sur place les crabes et écrevisses crus (Tran et al., 2004). Dans les zones endémiques du Vietnam, Doanh et al. (2005) ont rapporté que les enfants ont l’habitude de griller les crabes pendant environ 2 min avant de les consommer, ce qui ne permet pas évidemment de tuer les métacercaires puisque ces auteurs ont trouvé 12 métacercaires vivantes dans deux crabes grillés. En Afrique, la tendance est de bien faire cuire les aliments, mais certaines pratiques observées lors de la préparation des mets peuvent favoriser la contraction de la paragonimose. Parmi ces pratiques, nous pouvons citer le fait de goûter les plats avant cuisson, la contamination par les mains ou les ustensiles souillés par les formes larvaires de Paragonimus et l’ingestion directe d’eau contaminée par les crabes. D’autres pratiques ont été aussi observées au Cameroun où Ripert et al. (1981) ont rapporté que les femmes préposées à la pêche aux crabes d’eau douce dans l’ouest de ce pays, s’infestent en arrachant la première paire de pattes locomotrices (pinces), pour éviter d’être blessées par ces animaux, et elles les consomment crues sur le lieu de pêche. Ce type de consommation de crustacés crus sur le lieu de pêche a été également observé à Souanké (Nord ouest du Congo) chez des femmes pratiquant la pêche de la crevette à la nasse (Ndozi, 2000). 2.7.1.2. Habitudes non alimentaires Certaines pratiques traditionnelles à visée non alimentaire liées à la médecine ou à des croyances sont incriminées dans des cas de paragonimose humaine. Ainsi au Laos et en Thaïllande, la chair de crabe crue est administrée aux enfants pour ses propriétés fébrifuges (Strobel et al., 2005). Aussi, certaines tribus du Cameroun (Bakossi) et du Niger (Calabar), croient-elles que le crabe cru a des vertus énergétiques et qu’il augmente la fertilité des femmes ; de plus les petites filles énurétiques sont traitées par absorption de pattes antérieures de crevettes d’eau douce crues (Ndozi, 2000 ; Moyou-somo et al., 2003). 2.7.2. Facteurs écologiques et environnementaux Les facteurs écologiques et environnementaux déterminent la présence des hôtes intermédiaires et des hôtes définitifs de Paragonimus spp., et par voie de conséquence, la répartition en foyer d’endémie (Strobel et al., 2005). Les mollusques, hôtes intermédiaires THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 46 de Paragonimus spp. se rencontrent dans les petits cours d’eau avec persistance d’aires humaines en raison de la lenteur du courant et de la présence de végétation d’algues nutritives (Ndozi, 2000). 2.7.3. Facteurs liés à la migration des populations La migration des populations est une facette de la « triade : pauvreté, pollution et croissance démographique» reconnue pour favoriser les maladies infectieuses. En effet, des raisons économiques et politiques jouent ici un rôle important Ancha et Szifres, (1989), en parlant de la paragonimose, soulignent que « les guerres et les conflits internes qui s’accompagnent de migration de populations et provoquent une raréfaction des sources habituelles de protéines, peuvent contribuer à une fréquence accrue de l’infestation». A titre d’exemple, une épidémie de paragonimose où plus de 500 malades ont été infestés par Paragonimus uterobilateralis, est survenue lors de la guerre civile du Biafra au Nigéria suite à la consommation de crustacés et à la modification des habitudes alimentaires des populations déplacées (Nwokolo, 1972 ; Aka et al., 2008 c). Par ailleurs, le tourisme international et la floraison de mets exotiques constituent à n'en point douter des sources non négligeables de contamination. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 47 III. Généralités sur l’analyse des risques 1. Définitions 1.1. Analyse du risque De nombreuses définitions ont été données pour l’analyse de risque. Nous retiendrons celle de Ahl et al. (1993) reprise par Cerf et al. (1996) : l’analyse de risque est définie comme « une démarche scientifique faite dans le but d’identifier les dangers connus ou potentiels, d’en apprécier les risques, de les gérer et de communiquer à leur propos ». Elle peut être également définie comme une manière d’organiser les informations disponibles sur un événement potentiel donné, de les traduire en probabilités en tenant compte d’hypothèses, de la variabilité et de l’incertitude, et d’en déduire logiquement des décisions (Toma et al., 2002). L’analyse du risque permet donc de donner les moyens d’une évaluation du risque liée aux problèmes alimentaires rigoureusement scientifiques et des mesures préventives qui pourraient être utilisées afin de diminuer le risque (Schlundt, 2002). Il convient d’établir une distinction entre risque et danger, ces deux notions étant liées mais distinctes. 1.2. Danger Le danger est un agent chimique, biologique ou physique présent dans un aliment ou une propriété de cet aliment, susceptible d’avoir un effet adverse (Codex Alimentarius Commission, 2007). Selon Toma et al.(2002), cette notion peut être considérée sous deux angles. En effet, pour certains, un danger est constitué par tout agent biologique, chimique ou physique pouvant avoir un effet néfaste pour la santé (Salmonella, Trichinella spiralis) et pour d’autres le danger correspond à la maladie elle-même (la fièvre aphteuse, la salmonellose, la trichinellose, etc.). 1.3. Risque Le risque est « la probabilité de la survenue d’un danger, combinée à l’importance de ses conséquences indésirables» (Toma et al., 2002). Le risque se définit comme étant une fonction de la probabilité d’un effet néfaste sur la santé et de la gravité de cet effet, résultant d’un (ou plusieurs) danger(s) dans un aliment (Codex Alimentarius Commission, 2007). 2. Différents concepts de l’analyse des risques Une des difficultés rencontrées en santé animale et en santé publique vétérinaire est la coexistence de deux modèles de description et d’appellation des étapes de la démarche THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 48 en analyse de risque: d’une part, le modèle de l’Organisation Mondiale de la Santé animale (anciennement dénommée Office International des Epizooties, OIE) (Covello et Merkhoffer, 1993) et d’autre part, le modèle du Codex Alimentarius issu du groupe de travail de l’Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture et de l’Organisation Mondiale de la Santé (FAO/OMS) (OMS, 1995). Le modèle le plus largement utilisé en hygiène alimentaire est celui du Codex Alimentarius. 2.1. Analyse des risques selon le Codex Alimentarius La Commission du Codex Alimentarius appelée couramment le Codex Alimentarius ou même le Codex, fut créée en 1963 par la FAO et l’OMS. Le codex a pour mission de mettre au point des normes mondiales (ou régionales) sur les denrées alimentaires avec pour objectifs de protéger la santé et d’assurer des pratiques loyales dans le commerce des denrées alimentaires (Crepet, 2007). Le principe de l’analyse des risques tel que défini par le Codex Alimentarius se divise en trois parties que sont l’évaluation des risques (processus scientifique), la gestion des risques (processus décisionnel ou prérogative politique) et la communication sur les risques (processus d’information et de sensibilisation) (Nicolas, 2009). La figure 20 présente le modèle d’interaction entre les trois processus de l’analyse des risques. 2.1.1. Evaluation du risque L’évaluation des risques est un processus scientifique basé sur les résultats de l’étude de prévalence (dénombrement) d’un microorganisme donné dans un aliment donné consommé en l’état avec un échantillonnage représentatif (Lebres, 2006). Elle est composée d’une identification des dangers, d’une caractérisation des dangers, d’une évaluation de l’exposition au risque et d’une caractérisation du risque (AFSCA, 2005). 2.1.1.1. Identification des dangers On indique sur la base qualitative, quels dangers peuvent être associés à la consommation d’une denrée alimentaire spécifique et quels effets néfastes ils peuvent causer pour les consommateurs. Pour ce faire, on fait largement appel à la littérature existante (AFSCA, 2005). Il s’agit de déterminer la nature des contaminants des aliments (Crepet, 2007). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 49 Figure 20: Composantes de l’analyse de risque selon le Codex Alimentarius. Source : Codex Alimentarius Commission, 2003 Évaluation des risques: ▪ Identification des dangers ▪ Caractérisation des dangers ▪ Évaluation de l’exposition ▪ Caractérisation des risques Gestion des risques Communication sur les risques THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 50 2.1.1.2. Evaluation de l’exposition Pour évaluer l’exposition, on fait une estimation du niveau de danger auquel le consommateur est exposé au moment de la consommation (AFSCA, 2005). L’élaboration de l’approche de l’évaluation de l’exposition est basée sur deux processus distincts. Le premier, purement scientifique, est relatif à la prévalence du pathogène dans l’aliment. Le second est basé sur la collecte d’informations relatives aux principaux paramètres, soit : - le potentiel de croissance ou d’inactivation du pathogène (le mode de consommation de l’aliment considéré, la durée de stockage de l’aliment et l’intégrité de la chaîne de froid) - l’estimation de la fréquence et de la taille des portions d’aliment ingérées en fonction des populations susceptibles et non susceptibles - le sexe des consommateurs - l’âge des consommateurs - la contamination après transformation de l’aliment considéré (Lebres, 2006). 2.1.1.3. Caractérisation des dangers ou évaluation du rapport dose-effet Cette étape consiste en l’évaluation qualitative et quantitative de la nature des effets néfastes pour la santé associés au danger. Lorsque les données sont disponibles la relation dose-effet doit être établie (Sanaa et Cerf, 2002). La caractérisation des dangers est donc liée à l’examen de la relation dose-réponse. On détermine la relation dose-réponse en rassemblant pour un danger donné, des informations qualitatives et quantitatives sur les effets négatifs sur la santé d’une exposition à différentes doses (AFSCA, 2005). Aucune base de données n'existe sur les relations dose-effet, comme celles que l'on peut trouver pour les substances chimiques. La recherche bibliographique des données s'impose donc en prenant en compte les différentes sources de données disponibles : études expérimentales sur volontaires sains, études expérimentales sur animaux modèles, études épidémiologiques, menées à l'occasion ou non d'épidémies (Bonnard, 2001). Les réponses d’une population humaine aux expositions à un pathogène d’origine alimentaire sont très variables, ce qui indique que l’incidence de la maladie est fonction de plusieurs facteurs, parmi lesquels : - les caractéristiques de virulence du pathogène - le nombre de cellules ingérées - l’état de santé général - l’état immunitaire de l’hôte - les attributs de la matrice alimentaire qui modifient l’état du microbe ou de l’hôte THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 51 - l’effet de l’exposition préalable au pathogène d’origine alimentaire, sur la réponse immunitaire de l’hôte (Lebres, 2006). L’infection peut être considérée comme le franchissement avec succès par le micro- organisme pathogène des différentes barrières de l’hôte (Sanaa et Cerf, 2002). Pour l’évaluation du rapport dose-effet, deux types de modèles existent, les modèles empiriques qui reposent sur l’hypothèse d’une dose minimale et les modèles mécanistiques qui reposent sur aucun seuil de tolérance ou aucune dose minimale. 2.1.1.3.1 Modèles empiriques Les modèles empiriques reposent sur l’hypothèse d’un seuil de tolérance ou d’une dose minimale infectante pour chaque individu vis-à-vis d’un germe infectieux. Les modèles empiriques supposent une coopération entre les microorganismes ingérés faisant intervenir la notion de dose minimale infectante. Dans ce cas, l’infection est le résultat de l’action conjointe de plusieurs cellules bactériennes et elle ne devient possible que si k bactéries dépassent un seuil kmin. Pour une exposition à une dose supérieure à ce seuil de tolérance, l'infection va se déclencher. Pour une exposition à une quantité de germes inférieure, il n'y aura pas d'infection chez l'individu considéré. La distribution des seuils de tolérance est représentée par une fonction de densité de probabilité. Un des modèles les plus étudiés suppose que ce seuil de tolérance est distribué selon une fonction log-normale (Bonnard, 2001). 2.1.1.3.2 Modèles mécanistiques Les modèles mécanistiques considèrent que la probabilité de développer une infection dépend d’une part de la quantité de germes avec laquelle l’hôte entre en contact et d’autre part de la fraction de ces germes qui va effectivement atteindre un site d’infection (Bonnard, 2001). Ces modèles sans seuil supposent une indépendance d’action des microorganismes. Chaque bactérie a une chance non nulle de provoquer à elle seule l’infection (Sanaa et Cerf, 2002). L’infection est alors le résultat de processus séquentiels. Soient : P1 (j/d) : la probabilité pour un individu d’entrer en contact avec une quantité j de germes à partir d’un milieu induisant une exposition à une dose moyenne d (qui peut être le produit d’un volume et d’une densité). P2 (k/j) : la probabilité que k germes survivent, permettant d’initier une infection chez l’hôte, pour une quantité j de germes avec laquelle l’hôte est entré en contact. Si on considère ces deux processus comme indépendants et si kmin est le nombre THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 52 minimal de germes nécessaires dans l’organisme-hôte pour déclencher une infection, alors la probabilité P(d) de développer une infection pour une dose moyenne d’exposition d peut s’écrire : Formule (2) (Bonnard, 2001). Les modèles disponibles supposent tous l’absence de dose minimale. Les trois principaux modèles utilisés en appréciation quantitative des risques microbiologiques sont : le modèle exponentiel, le modèle Bêta-Poisson et le modèle Weibull-Gamma (Sanaa et Cerf, 2002). Le modèle exponentiel s’adapte aux données obtenues sur les virus et les protozoaires (Giardia et Cryptosporidium). Le modèle exponentiel est un modèle sans seuil, où la probabilité de survie et de l’initiation de l’infection (R) est constante et le nombre de bactéries n ingérées n’est pas parfaitement connu mais supposé suivre une distribution de Poisson de paramètre d. La distribution de Poisson est applicable au cas où la contamination de l’aliment est considérée comme homogène. Cette distribution convient parfaitement aux aliments liquides. La probabilité d’être infecté suite à l’ingestion d’une portion d’aliment dans lequel la contamination moyenne est égale à d s’exprime de la façon suivante : Formule (3) (Sanaa et Cerf, 2002). Le modèle Bêta-Poisson s’adapte aux données obtenues sur les bactéries entériques (Vibrio, Salmonella, Shigella, Campylobacter) (Haas et al., 1999). Si l’on fait l’hypothèse à partir du modèle exponentiel, que la probabilité d’infection liée à l’ingestion d’une bactérie varie entre les individus, et que l’on attribue à R une distribution Bêta de paramètres α et β, nous obtenons par une approximation mathématique, le modèle Bêta- Poisson : P= 1- (1 + d/β)-α ou P = 1 – [1+d/d50 (2 1/α -1)]-α Formule (4) P est la probabilité de maladie ou d’infection, d est la dose moyenne de l’agent pathogène ingérée (la dose d suit une loi de Poisson : d’où le nom attribué au modèle) et d 50 la dose médiane (provoquant l’infection chez 50 % des personnes ayant consommé l’aliment) ; α et β sont des paramètres qui décrivent la sensibilité de l’hôte (suivant une loi Bêta) et qui sont spécifiques à l’agent pathogène considéré (Sanaa et Cerf, 2002). THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 53 Le modèle Weibull-Gamma est une extension du modèle Weibull qui tient compte de l’hétérogénéité hôte/pathogène et dont le paramètre permettant d’estimer la probabilité de maladie liée à l’ingestion d’une cellule bactérienne suit une distribution Gamma de paramètres α et β. L’expression du modèle Weibull-Gamma est : P = 1- [1+ db/ ß]-α Formule (5) P est la probabilité de l’infection, d la dose ingérée de micro-oganismes, α, β, et b sont les paramètres du modèle. Comme dans les autres modèles, d est la dose moyenne de l’agent pathogène (Sanaa et Cerf, 2002). 2.1.1.4. Caractérisation des risques La probabilité de contracter une maladie d’origine alimentaire dépend de l’évaluation de l’exposition au risque et de la relation dose-réponse (Lebres, 2006). Les informations collectées au cours des étapes précédentes sont regroupées et les maladies ou troubles sont classées selon leurs gravités et leurs conséquences économiques et sociales. Ce classement doit ensuite permettre de prendre une décision concernant l’acceptation ou la non acceptation du risque donné. La caractérisation des risques doit également englober tous les facteurs qui peuvent avoir un effet sur le risque, et indiquer le degré de fiabilité de l’estimation du risque. Il faut toutefois faire remarquer que la probabilité avec laquelle un danger donné se présente ne peut jamais être réduite à zéro. Il faudra donc toujours accepter un certain niveau de risque, et cette acceptation dépendra fortement de l’effet induit sur la santé de l’homme, de la perception des risques, des aspects culturels, des aspects sociaux et des problèmes économiques qui y sont liés, ainsi que de la législation en vigueur (AFSCA, 2005). Le risque peut être caractérisé par le calcul du risque annuel d'infection lié à de multiples expositions à l’aide de la formule 6. P’ = 1- (1- P) 365 Formule (6) (Smeets et al., 2008) P’ est la probabilité annuelle d’infection, P est la probabilité d’infection calculée précédemment par la relation dose-réponse donnée par la formule 4. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 54 2.1.2. Gestion des risques La gestion du risque est définie dans le codex comme le processus consistant à mettre en balance les différentes politiques possibles compte tenu des résultats de l’évaluation des risques et au besoin à choisir et à mettre en œuvre les mesures de contrôle et notamment les mesures réglementaires appropriées (FAO, 1997). 2.1.3. Communication sur les risques La communication du risque est une procédure interactive d’échange d’informations entre les parties intéressées concernant la nature, la grandeur, la signification ou le contrôle du risque (Covello, 1992). La communication du risque est définie par l’OIE comme « la démarche interactive d’échange d’informations relatives au risque entre les personnes chargées d’apprécier le risque, celles chargées de le gérer et toutes les autres parties intéressées » (Anonyme 3, 1997). 2.2. Analyse des risques selon l’Organisation Mondiale de la Santé Animale (OIE) Le principe de l’analyse des risques tel que défini par l’OIE créée en 1924 se divise en quatre parties : - l’identification des dangers - l’appréciation du risque - la gestion du risque - la communication relative au risque. La figure 21 présente le modèle d’interaction entre les quatre processus de l’analyse des risques selon l’OIE. L’identification du danger, la gestion du risque et la communication du risque sont les mêmes concepts et correspondent aux mêmes définitions que celles précisées pour l’analyse des risques selon le Codex Alimentarius. L’appréciation du risque correspond, en fait, d’une part, à une estimation du risque et d’autre part, à l’évaluation du risque (Toma et al., 2002). A coté de ces deux modèles, il y’a le système HACCP qui identifie les dangers spécifiques et les mesures pour leur contrôle dans la but d’assurer la sécurité des aliments. 2.3. Analyse participative des risques Dans les pays développés, l’analyse des risques est la meilleure pratique actuelle et la clé de voûte de la réglementation à la fois de la sécurité alimentaire domestique et du commerce international. Cependant, son utilisation dans les pays en développement a été THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 55 limitée particulièrement dans le secteur informel où les mesures de contrôle des risques sont insuffisantes voire quasi inexistantes du fait de l’absence de l’analyse des risques dans les chaînes alimentaires (production et distribution des aliments). L’analyse des risques n'a pas été appliquée aux marchés nationaux où les gens les plus pauvres vendent et achètent de la nourriture, où les niveaux d'hygiène et de sécurité sont les plus bas, et la vulnérabilité d'origine alimentaire de la maladie la plus élevée (Grace et al., 2008). Face au déficit d’informations sur les risques et les moyens de gestion de ces risques, de nouvelles approches sont promues en associant la « participation » aux approches de l’OIE et de la FAO/OMS (Codex Alimentarius). Depuis leur introduction dans les années 1970, les méthodes et les techniques participatives sont devenues des outils centraux pour le développement communautaire et ont été appliquées dans une variété de contextes et secteurs. Les méthodes participatives sont promues sur la base qu'elles sont plus efficaces, plus durables, moins coûteuses et plus éthiques dans leur inclusion des pauvres dans la planification et des décisions qui les touchent (Duraiappah et al., 2005). Ces dernières années ont vu beaucoup d'intérêt dans l'adaptation de l'analyse des risques pour les pays en développement. L’analyse participative des risques (APR) est une combinaison des approches participatives (équité, inter –et transdisciplinarité) et les méthodes HACCP (Hazards Analysis of Critical Control Point), et Codex Alimentarius (OIE / OMS / FAO) qui prend en compte la variabilité, l’incertitude, la relativité et la complexité des prises de décisions. L’analyse du risque par les méthodes HACCP et le Codex Alimentarius est un processus linéaire, complexe et difficile à mettre en œuvre dans le secteur informel, d’où l’émergence des guides de bonnes pratiques et de la participation pour prendre en compte des données qualitatives. L’APR peut donc contribuer à la gestion efficace, concertée et durable du risque. Elle implique tous les acteurs de la chaîne des denrées alimentaires et permet de capter à travers des entretiens, les informations qui pourraient échapper au secteur médical surtout en matière d’exposition, de dose-effet et de caractérisation du risque (Bonfoh, 2010). En Afrique, deux groupes de recherche travaillent actuellement sur l’APR : l'un au Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d'Ivoire (CSRS) et l'autre à l'International Livestock Research Institute (ILRI) au Kenya (Grace et al., 2010). La figure 22 présente le modèle d’interaction entre les trois processus de l’analyse participative des risques. THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 56 Figure 21: Composantes de l’analyse de risque selon OIE Source : Toma et al., 2002 Figure 22: Concept d’analyse participative des risques Source : Bonfoh, 2010 Identification du danger Appréciation du risque Gestion du risque Communication relative au risque THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 57 3. Réalisation de l’analyse des risques La réalisation d’une analyse des risques commence par la construction d’un arbre d’événements qui est un modèle schématique (Vose, 2005), représentant autant que possible la réalité. Ce modèle schématique permet de déterminer les informations à collecter aux différentes étapes et l’analyse des risques peut être modélisée soit de manière déterministe, où l’on utilise une valeur moyenne estimée pour chaque paramètre, soit de manière probabiliste, où l’on tient compte de la distribution de probabilité de chaque paramètre (Toma, 2002). La méthode déterministe est plus simple et rapide mais elle donne un résultat uniquement ponctuel. Quant à la méthode probabiliste, elle nécessite des distributions de probabilités pour représenter soit la variabilité, soit l’incertitude sur un paramètre et chaque variable entrant dans le modèle probabiliste sera remplacée par une loi de distribution selon la nature de la variable et du processus stochastique sous-jacent (Pouillot et al., 2002). La méthode probabiliste est souvent utilisée pour la caractérisation de certains processus aléatoires parce qu’elle aboutit à une distribution de probabilité du risque et permet d’affiner l’interprétation des résultats issus du modèle. Le modèle global est constitué d’une succession de modèles partiels où les variables de sortie à une étape servent de variables d’entrée pour les étapes suivantes (Nauta, 2001), ce qui fait qu’ à chaque étape, on obtient une représentation déterministe ou probabiliste des paramètres de sortie (Pouillot et al., 2002). Les différents modules qui constituent les étapes du modèle et qui établissent les relations entre variables d’entrée et de sortie, peuvent être construits à partir des données récoltées sur le terrain ou prises dans la littérature scientifique et lorsque le modèle est construit, il est possible d’obtenir des distributions de probabilité des variables en utilisant les simulations de type Monte Carlo (Thusfield, 2007). Avec cette méthode, chaque variable est considérée comme échantillonnée dans sa distribution de probabilité et pour produire un grand nombre de scénari ou d’itérations, on réalise un échantillonnage aléatoire de chaque distribution de probabilité dans le modèle. Les distributions des variables du modèle dépendent généralement des valeurs échantillonnées pour d’autres variables en amont dans le modèle et le modèle génère ainsi une distribution finale suite à la succession des variables des différents modules traduisant le risque et intégrant toutes les sources de variation et d’incertitude rencontrées dans le processus (Pedro et Boris, 2005). Après la construction du modèle global, l’exploitation des résultats peut être aussi réalisée par une analyse de sensibilité qui permet d’identifier les variables qui ont le plus d’influence sur un paramètre d’intérêt (Zwietering et Van Gerwen, 2000). L’analyse de THESE DE DOCTORAT Première partie : revue bibliographique TRAORE Sylvain Gnamien 58 sensibilité peut être symbolisée sous la forme d’un graphique type tornade où la longueur des barres représente l’influence de la variable sur la variable d’intérêt (Vose, 2008). THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 59 DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 60 I. Matériel 1. Matériel biologique Le matériel biologique utilisé pour la recherche de Vibrio et de Paragonimus est constitué d’une part, des crabes des genres Cardisoma (crabes poilus), Callinectes (crabes plats de lagune) et d’autre part des crevettes des genres Macrobrachium et Penaeus. Celui utilisé pour la recherche d’œufs de Paragonimus et d’autres parasites est constitué des selles et des crachats des patients des centres antituberculeux d’Adjamé et de Treichville, et des selles des élèves de N’Gatty et d’Allaba. Les crachats des patients de ces deux centres antituberculeux ont été aussi utilisés pour la recherche du Bacille de Koch (BK). La figure 23 montre les photographies des crabes des genres Cardisoma (a), Callinectes (b) et des crevettes des genres Penaeus (c) et Macrobrachium (d). a b c d Figure 23: Photographies des crabes des genres Cardisoma (a) et Callinectes (b), et celles des crevettes des genres Penaeus (c) et Macrobrachium (d) THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 61 2. Réactifs et milieux de culture Les suspensions-mères pour la recherche de Vibrio dans les crustacés ont été préparées avec de l’eau peptonée alcaline à 2 % de NaCl. Cette solution a également été utilisée pour le dénombrement de Vibrio par la méthode du Nombre le Plus Probable (NPP). Le milieu Thiosulfate Citrate Bile Saccharose (TCBS) (Biorad, Marnes, la coquette) a servi à isoler les espèces du genre Vibrio. La gélose nutritive alcaline (GNA) (Biorad, France) à 2 % de NaCl a été utilisée pour l’obtention de souches pures de Vibrio. Les milieux du portoir de Leminor, des disques d’OrthoNitroPhényl β-D- Galactopyranoside (ONPG), le milieu liquide sans peptone de Falkow pour la recherche de l’ornithine décarboxylase, le bouillon cœur-cervelle, un kit de Gram, le réactif de Kovacs ainsi que des galeries API 20 E ont été utilisés pour l’identification biochimique des espèces de Vibrio. Pour la caractérisation moléculaire des souches de Vibrio isolées des crustacés, la gélose Marine Agar (DICO Laboratory, USA) avec le kit de purification InstaGene Matrix, de l’agarose à 2 %, un tampon Tris-borate-EDTA (TBE, France), du Bromure d'Éthidium (BET, France), un mix PCR constitué d’eau distillée stérile (H2O), du MgCl2, des désoxy ribonucléotides triphosphate (dNTPs, France) et des amorces ont été utilisés. La souche V. cholerae N° CNRVC 980324 a été utilisée comme témoin positif pour la confirmation par PCR des espèces de V. cholerae identifiées par la galerie API 20 E et la recherche des gènes de virulence ctxA et ctxB. La souche V. mimicus N° CNRVC 000004 a été utilisée comme témoin négatif pour la confirmation par PCR des espèces de V. cholerae identifiées par la galerie API 20 E et la souche V. cholerae non O1 ; non O 139 N° CNRVC 040221 a été utilisée comme témoin négatif pour la recherche des gènes de virulence ctxA et ctxB. Les souches V. parahaemolyticus N° CNRVC 010089 et V. parahaemolyticus N° CNRVC 020234 ont été utilisées comme témoins positifs pour la confirmation par PCR des espèces de V. parahaemolyticus identifiées par la galerie API 20 E. La souche V. alginolyticus N° CNRVC 950768 a été utilisée comme témoin négatif pour la confirmation par PCR des espèces de V. parahaemolyticus identifiées par la galerie API 20 E. La souche V. parahaemolyticus N° CNRVC 0100899 a été utilisée comme témoin positif pour la recherche des gènes de virulence tdh et trh et la souche V. parahaemolyticus N° CNRVC 020234 a été utilisée comme témoin négatif pour la recherche des gènes de virulence tdh et trh. Les analyses parasitologiques des selles des patients et des élèves ont été réalisées en utilisant les techniques de Ritchie, de Kato-Katz et d’éther-concentration. Ainsi de l’eau THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 62 formolée à 10 % et de l’éther ont été utilisés dans la technique de Ritchie. Les solutions d’acide formique d’acétate de sodium (0,85% de NaCl) et du diéthyl éther, ont été utilisées dans la technique d’éther-concentration. Le vert de Malachite et le glycérol ont été utilisés pour la technique de Kato-Katz. Pour la recherche du bacille tuberculeux dans les crachats des patients, l’auramine a été utilisée, et pour la recherche d’œufs de Paragonimus dans les crachats des patients des deux centres antituberculeux, du NaOH a été utilisé. 3. Appareil et équipement Les coordonnées des marchés de prélèvement des crustacés, des centres antituberculeux et des écoles primaires ont été obtenues à l’aide d’un GPS (Garmin etrex). Un dictaphone a été utilisé pour l’enregistrement des « focus group discussions » ou discussions de groupe. Les températures auxquelles les crustacés sont vendus sur les marchés, ont été mesurées directement dans les contenants de vente (paniers, cuvettes ou assiettes) à l’aide d’un multimètre (WTW 341 i, Allemagne). Les crustacés ont été broyés dans un Stomacher (Colworth 400) pour la recherche de Vibrio. La balance (AG 204 Delta rouge) a servi à la pesée des milieux de culture qui après préparation ont été stérilisés à l’autoclave (HMC, Suisse). Les manipulations bactériologiques ont été réalisées sous une hotte à flux laminaire (Cytair, France). L’observation de la mobilité des bactéries s’est faite au microscope optique (Carl Zeiss 2060571, Allemagne) Les métacercaires retrouvées dans les crustacés et les souches de Vibrio ont été conservées au congélateur (Zaiko UFC-Z 150 S, France). Les analyses des crachats et des selles des patients et des élèves ont nécessité l’utilisation d’une centrifugeuse (CWS 4236). II. Méthodes 1. Sites d’études  Choix des sites d’études et des marchés de prélèvement des crustacés Les villes d’Abidjan et de Dabou (à 49 km d’Abidjan sur le littoral) ont été choisis comme sites d’étude en se basant d’une part, sur les observations d’une prospection que nous avons effectuée d’août à septembre 2008, et d’autre part, sur des données de littérature. Cette prospection a en effet été réalisée sur les grands marchés des villes d’Abidjan, de Dabou, de Divo, de Grand-Lahou, de Lakota, de Man et de San Pédro et THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 63 dans les centres antituberculeux (CAT) ou les centres de dépistage de la tuberculose (CDT) de ces villes. La prospection a permis d’observer que les crabes vendus sur ces marchés appartiennent au genre Callinectes (crabes plats) et à l’espèce Cardisoma armatum (crabes poilus). Les crevettes appartiennent aux genres Macrobrachium (grosses crevettes) et Penaeus (petites crevettes) et aucune espèce d’écrevisse n’est vendue sur les marchés des villes sus-citées. Ces crustacés ont été donc choisis pour la recherche de Vibrio et de métacercaires de Paragonimus. Elle a permis en outre de remarquer que les crustacés qui sont vendus sur les grands marchés d’Abidjan proviennent pour la plupart de Dabou et que le marché de Yopougon/Siporex occupe une place très importante dans le circuit de distribution des crustacés. Certains marchés comme le grand marché d’Attécoubé, le marché des deux- plateaux, les marchés d’Avocatier et de l’Habitat dans la commune d’Abobo qui s’approvisionnent au marché de Yopougon/Siporex, n’ont pas été retenus pour l’étude ainsi que le marché du plateau qui n’est pas un marché de vente de crustacés. Par ailleurs, le marché de Yopougon/Siporex occupe une place très importante dans la vente des crustacés, et la ville d’Abidjan est un important point de débarquement de la pêche artisanale maritime. En effet, en 1982, les débarquements du crabe Callinectes amnicola en lagune Ebrié était de 1 000 tonnes au point de vente de Dabou (Cormier- Salem, 1999) et en 2005 Abidjan était le point de débarquement le plus important de la pêche artisanale maritime avec 7650 tonnes (FAO, 2008). Les grands marchés d’Adjamé (Forum), de Koumassi, de Marcory, de Port Bouët, de Treichville, de Yopougon/Siporex, repertoriés sur la figure 24 et le grand marché de Dabou ont donc été retenus pour le prélèvement des crustacés en vue de la recherche de Vibrio et de métacercaires de Paragonimus. Une enquête ménage sur la consommation des crustacés a été réalisée dans les dix communes d’Abidjan et une enquête auprès des vendeuses de crustacés a été réalisée sur ces 7 marchés. Les deux principaux centres antituberculeux (CAT) d’Abidjan (le CAT d’Adjamé et le CAT de Treichville), repertoriés sur la figure 24, ont été choisis parce qu’ils sont les plus grands centres antituberculeux de la Côte d’Ivoire. Ils reçoivent le plus de patients qui viennent consulter pour une tuberculose pulmonaire et parmi lesquels, des cas de paragoinimose humaine pourraient être dépistés du fait que ces deux maladies ont les mêmes symptômes. La recherche d’œufs de Paragonimus et du bacille tuberculeux dans THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 64 les crachats et leur recherche dans les selles des patients ont été effectuées dans ces deux centres antituberculeux. Les écoles primaires des villages de N’Gatty et d’Allaba (Dabou) (figure 25) ont été choisies parce que les crustacés qui proviennent de Dabou et qui sont vendus sur les marchés d’Abidjan, sont pêchés pour la plupart dans ces deux villages. La recherche d’œufs de Paragonimus dans les selles des élèves a été effectuée dans ces deux écoles primaires. Les coordonnées des marchés de prélèvement des crustacés, des deux CAT d’Aidjan et des deux écoles primaires de Dabou sont en Annexe I. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 65 Figure 24: Localisation géographique des grands marchés de prélèvement des crustacés à Abidjan et des CAT d’Adjamé et de Treichville Source : BNETD Figure 25: Localisation géographique du grand marché de Dabou et des deux écoles primaires de Dabou Source : BNETD THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 66 2. Enquête auprès des ménages et des vendeuses de crustacés pour la détermination des potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés aux traitements et à la consommation des crustacés 2.1. Calcul de la taille des échantillons de ménages enquêtés à Abidjan Le calcul de la taille des échantillons de ménages enquêtés à Abidjan a été fait en se basant sur les résultats d’une enquête préliminaire sur la consommation des crustacés que nous avons réalisé à Yopougon (Sideci) pour déterminer le pourcentage de ménages qui consomment les crustacés au niveau d’Abidjan. Ce pourcentage était estimé à 96 %, avec une erreur de 5 %, une précision de 5 % et une puissance de 80 % sur ce pourcentage nécessitera un échantillon d’au moins 60 ménages déterminé selon la formule (7) ci-après. Formule (7) (OMS, 1991) avec n : la taille minimale des crustacés E : la marge d’erreur tolérée (%) estimée ici à 5 % q = 100 – p p : la proportion attendue des crustacés à analyser. Cette taille minimale a été multipliée par 2 (n=120) de sorte à augmenter le nombre de ménages afin de mieux les répartir dans les différentes communes et d’avoir une estimation plus précise des résultats d’enquête. Les 120 ménages à enquêter ont été repartis dans l’ensemble des dix communes de la ville d’Abidjan proportionnellement à chaque commune c'est-à-dire par choix raisonné en tenant compte du nombre de ménages dans chaque comme. Le nombre de ménages dans chaque commune a été obtenu grâce au recensement général de la population ivoirienne de 1998 (Institut National de la Statistique de la Côte d’Ivoire, 1998). La carte de chacune des dix communes de la ville d’Abidjan (Annexe II) a été obtenue auprès du BNETD et les quartiers de chacune des dix communes répertoriés sur ces cartes ont été listés, puis un quartier par commune a été tiré de manière aléatoire et l’enquête s’y est déroulée. Le tableau V donne le nombre de ménages enquêtés par commune. n = pq / (E/1,96)2 THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 67 Tableau V: Nombre de ménages enquêtés par commune Communes Quartiers Nombre de ménages enquêtés Abobo Abobo-Baoulé 24 Adjamé Mairie II 11 Attécoubé Locodjoro 09 Cocody Cité des cadres 11 Koumassi Ancien Koumassi 15 Marcory Marché 08 Plateau Gare lagune 01 Port-Bouet Cité douanes 10 Treichville Jeanne d’Arc 04 Yopougon Municipalité 27 Total 120 2.2. Critères d’inclusion des ménages Les ménages qui consomment les crustacés à Abidjan ont été inclus dans l’étude. 2.3. Critères de non inclusion des ménages Les ménages qui ne consomment pas les crustacés n’ont pas été inclus dans l’enquête. 2.4. Réalisation de l’enquête ménage La méthode des stylos combinée à la méthode des nombres aléatoires a été utilisée pour réaliser l’enquête sur la consommation des crustacés auprès des ménages à Abidjan (Bakhshi et Trani, 2007). La méthode du stylo consiste à se placer sur le carrefour central de la zone urbaine considérée, à jeter un stylo en l’air en le faisant pivoter simultanément. La direction au sol indiquée par la tête du stylo correspond à l’axe urbain à enquêter. Si la direction du stylo est placée entre deux axes, l’enquêteur opte pour l’axe situé à la gauche de la tête du stylo (la gauche étant déterminée avec l’observateur « derrière le stylo »). Si les habitations ne sont pas situées sur des axes bien matérialisés ou sur des sentiers sinueux (bidonvilles, relief escarpé), l’enquêteur empruntera le sentier indiqué par le stylo et restera sur ce dernier peu importe l’orientation qu’il prend par la suite. Si, en suivant ce sentier, l’enquêteur rencontre un carrefour similaire à celui d’où il est parti, il réitérera la même opération (méthode du « stylo ») pour poursuivre son enquête. Une fois la rangée de THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 68 maisons enquêtée, l’observateur reviendra au premier carrefour pour faire un nouveau jet de stylo (si le nombre d’enquêtes requis pour la journée n’est pas satisfaisant). Si, lors d’un nouveau lancé, le stylo indique un axe déjà enquêté, l’enquêteur doit relancer le stylo. Si tous les axes ont été sélectionnés, l’enquêteur devra recommencer à zéro (en considérant tous les axes comme non enquêtés) en écartant les maisons qui ont déjà fait l’objet d’une enquête. Dans une concession, si plusieurs ménages cohabitent, la méthode du stylo est employée de nouveau pour sélectionner le ménage à enquêter. Une fois une direction choisie via la méthode du « stylo », l’opérateur prendra une table de chiffres aléatoires et les yeux fermés pointera au hasard son stylo sur la table : le chiffre indiqué correspond au rang de la maison depuis le carrefour à partir duquel commencer l’enquête (par exemple si le chiffre est 8, l’enquêteur ira directement à la 8ème maison sur l’axe (côté gauche). A partir de cette maison, l’enquêteur investiguera dans toutes les maisons suivantes jusqu’à sortir de sa zone d’enquête. Si le chiffre obtenu est supérieur au nombre total de maisons, il soustraira ce nombre au chiffre obtenu autant de fois que nécessaire pour obtenir un chiffre inférieur à ce nombre. Si, au cours de l’enquête, l’ensemble des axes possibles a été sélectionné et que l’enquêteur doit revenir sur un axe déjà parcouru, il optera pour le côté droit de l’axe pour la détermination des foyers à enquêter. Le questionnaire utilisé pour l’enquête ménage (Annexe III) a porté sur 3 parties essentielles à savoir, (i) des informations sociales et démographique, (ii) les habitudes alimentaires et les techniques culinaires des ménages et (iii) les facteurs de risque d’une potentielle infection suite à la consommation des crustacés. 2 5. Enquête auprès des vendeuses de crustacés Au total cinquante sept vendeuses de crustacés sur les marchés d’Adjamé, de Dabou, de Koumassi, de Marcory, de Port Bouët, de Treichville et de Yopougon/ Siporex ont accepté de répondre à notre questionnaire (Annexe IV). Le questionnaire destiné aux vendeuses de crustacés a porté sur 3 parties essentielles à savoir, (i) informations sociales et démographiques, (ii) la provenance des crustacés et les facteurs de risques de contraction des infections à Vibrio et des infestations à Paragonimus et (iii) les types de crustacés vendus. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 69 3. Recherche de Vibrio, de métacercaires de Paragonimus et celles d’autres trématodes dans les crustacés 3.1. Echantillonnage des crustacés sur les marchés 3.1.1. Taille des échantillons de crustacés pour la recherche de Vibrio Le calcul de la taille des échantillons de crustacés pour la recherche de Vibrio a été fait en se basant sur les travaux réalisés au Maroc par Cohen et al. (2007) sur la recherche de Vibrio dans les produits de la pêche. Ces travaux ont montré une prévalence de contamination des crevettes de 5,7 %. Une erreur de 5%, une précision de 5 % et une puissance de 80 % sur cette prévalence, nécessitera un échantillon d’au moins 76 crustacés calculé par la formule (7). Vu la faible prévalence de Vibrio, nous avons décidé de prélever autant de crustacés que nous permettait notre chronogramme afin de maximiser nos chances de trouver des crustacés contaminés par Vibrio. 3.1.2. Taille des échantillons de crustacés pour la recherche de métacercaires de Paragonimus et celles d’autres trématodes Le calcul de la taille des échantillons, effectué à partir de la formule 7, a été réalisé à partir de l’étude de Aka et al. (2009) à Lauzoua dans le sud-ouest de la Côte d’Ivoire sur l’infestation des crustacés par les métacercaires de Paragonimus. Cette étude a permis de trouver un taux d’infestation de 20 %. Une erreur de 5 % sur ce taux d’infestation nécessitera un nombre d’au moins 246 crustacés. 3.1.3. Technique de prélèvement et transport des crustacés Les échantillons ont été prélevés dans les contenants de vente par les commerçantes elles-mêmes, de manière aléatoire et par choix raisonné c’est-à-dire de façon proportionnelle au nombre de vendeuses sur chaque marché. Un échantillon correspond à un crabe ou un tas de crevettes (en moyenne 10 crevettes). Chaque échantillon (crabe vivant ou un tas de crevettes mort) prélevé par la vendeuse a été mis dans un sachet Stomacher stérile puis étiqueté. Les échantillons ont été ensuite transportés dans une glacière contenant de la glace jusqu’au laboratoire de microbiologie du Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d’Ivoire (CSRS) pour être analysés. Les prélèvements et les analyses des crustacés se sont déroulés de 2009 à 2010. Les prélèvements se sont effectués les matins entre 7 et 9 heures et lors de ces prélèvements, une fiche a été renseignée sur le type, le nombre de crustacés prélevés, la provenance (zone de pêche) et la température de vente des crustacés (Annexe V). La provenance des THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 70 crustacés est indiquée par les vendeuses. En moyenne, 15 échantillons de crustacés ont été prélevés et analysés par semaine. 3.1.4. Mesure de la température de vente des crustacés Les températures auxquelles les crustacés sont vendus ont été mesurées directement dans les contenants de vente (paniers, cuvettes ou assiettes) à l’aide d’un multimètre. Pour ce faire, la sonde du multimètre a été introduite dans le contenant de vente des crustacés et la température s’est affichée directement sur l’écran de l’appareil. La mesure de la température permet d’apprécier le nombre de fois que les bactéries d’altération se multiplient dans les crustacés. La relation comparée entre la multiplication des bactéries d’altération (m) à une température quelconque (t) et celle à 0˚C considérée comme la température de référence, a été établie par Bremner et al. (1987) et elle est libellée par la formule (8). m = 1+ 0,1 x t Formule (8) De cette équation on déduit alors m, la multiplication des bactéries d’altération. 3.2. Recherche de Vibrio dans les crustacés 3.2.1. Préparation de la suspension-mère et des dilutions décimales La méthode canadienne MFLP-37 relative à l'isolement et au dénombrement de Vibrio spp. (Anonyme 4, 2006 b) dans les fruits de mer a été utilisée pour la numération des Vibrio dans les crustacés en milieu liquide par la méthode du NPP (nombre le plus probable). La détermination du sexe des crevettes n’étant pas aisée, nous nous sommes limités uniquement à la détermination du sexe des crabes dans notre étude. Ainsi, de manière aseptique, le sexe des crabes est déterminé, les échantillons (crabes et crevettes) sont broyés séparément (y compris la carapace pour les crabes) à l’aide d’un Stomacher, puis 25 g du broyat sont ajoutés à 225 mL d’eau peptonée stérile à 2 % de NaCl. Le mélange homogénéisé constitue la suspension-mère. Un volume de 1 mL de la suspension-mère est ajouté à 9 mL d’eau distillée stérile à 2 % de NaCl contenus dans un tube à essai et le tout est homogénéisé. La dilution 10-2 est ainsi obtenue. Ensuite 1mL de la dilution 10-2 est ajouté à 9 mL d’eau distillée stérile à 2 % de NaCl contenu dans un autre tube à essai pour obtenir la dilution 10-3. Des dilutions subséquentes sont ainsi réalisées jusqu’à la dilution 10-7. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 71 3.2.2. Dénombrement de Vibrio Le dénombrement de Vibrio s’est fait en milieu liquide par la méthode du NPP (Nombre le Plus Probable). Ce dénombrement a consisté à réaliser des ensemencements de trois tubes à essai contenant chacun 10 mL d’eau peptonée alcaline stérile à 2 % de NaCl avec chacune des dilutions subséquentes réalisées auparavant avec les suspensions mères de chaque échantillon. L’incubation s’est faite à 37°C pendant 24 heures. Au bout de ce temps, la présence de trouble dans les tubes traduit un développement de microorganismes. Le nombre de Vibrio est ensuite déterminé par la méthode de Mac Grady qui consiste à assigner à chaque résultat positif le chiffre 1 et à chaque résultat négatif le chiffre 0. Trois chiffres sont obtenus par dilution (à partir des 3 tubes ensemencés pour chaque dilution). Ces 3 chiffres sont ensuite additionnés, ce qui donnera un autre chiffre pour chaque série de dilutions. Ces derniers chiffres seront alors utilisés pour faire des combinaisons de 3 chiffres de la plus faible à la plus forte dilution. Parmi les combinaisons obtenues, la plus grande et si possible inférieure à 330 est retenue. La combinaison retenue correspond à un nombre n lu sur la table de Mac Grady (Annexe VI). Le nombre N de germes par gramme d’échantillon est déterminé par la formule suivante: Formule (9) n : valeur du NPP lu dans la table de Mac Grady 10x : dilution correspondant au 1er chiffre de la combinaison retenue. 3.2.3. Isolement des Vibrio A partir des bouillons utilisés pour le dénombrement par la méthode du NPP, un isolement sur milieu TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose, Bio-Rad, Marnes, la coquette) préalablement coulé en boîtes de Pétri a été effectué. Les boîtes de Pétri sont ensemencées par stries afin d’obtenir des colonies bien isolées. Après 24 h d’incubation à 37°C, les colonies jaunes et plates de 2 à 3 mm de diamètre présomptives de Vibrio cholerae, les colonies jaunes de grande taille présomptives de V. alginolyticus, les colonies jaunes ou translucides présomptives de V. fluvialis et de V. vulnificus et les colonies incolores à centre vert présomptives de V. parahaemolyticus isolées sur les boîtes de Pétri ont été retenues comme celles caractéristiques des Vibrio. Quatre colonies caractéristiques pour chaque espèce présomptive de Vibrio isolée sur chacune des boîtes de Pétri ont été N=n/10x THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 72 repiquées sur la gélose nutritive alcaline (GNA) à 2 % de NaCl (Biorad), puis incubées 24 h à 37°C pour l’obtention de souches pures. 3.2.4. Identification morphologique et biochimique L’identification des souches isolées s’est faite par la recherche des caractères biochimiques et morphologiques des Vibrio. L’identification morphologique s’est faite sur les souches pures par la recherche du type de mobilité et du type de Gram. L’identification biochimique est réalisée sur les souches pures, par la recherche de l’oxydase, de la lysine décarboxylase, de l’ornithine décarboxylase, de l’uréase, de la tryptophanase, de la β- galactosidase et de l’utilisation des glucides (glucose, lactose et mannitol) (Rodier et al., 1996). L’ensemble des tests biochimiques et des tests morphologiques utilisés lors de l’identification de Vibrio sont résumés dans le tableau VI. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 73 Tableau VI: Tests utilisés pour l’identification des souches de Vibrio Tests morphologiques Caractère recherché Milieu ou réactif Réaction positive Réaction négative Mobilité Bouillon cœur- cervelle Mobilité polaire Immobile ou autres types de mobilité Type de Gram Kit de Gram Bacille Gram- Bacille Gram+ Tests biochimiques Caractère recherché Milieu ou réactif Réaction positive Réaction négative Production d’oxydase Bandelettes réactives Coloration bleue ou violette Incolore Production d’uréase Urée-Tryptophane Coloration rouge après 24 h d’incubation à 37°C Orange Production de Tryptophanase Urée-Tryptophane Anneau rouge après 2 à 3 gouttes de réactif de Kovacs Anneau orange Fermentation du glucose Kligler-Hajna Culot jaune après 24 h d’incubation Culot rouge Utilisation du lactose Kligler-Hajna Pente jaune après 24h d’incubation Pente rouge Production de Β-galactosidase Disque d’ONPG Coloration jaune après 1h d’incubation à 37°C Incolore Fermentation du mannitol Mannitol-Mobilité Coloration jaune après 24 h d’incubation à 37°C Coloration rouge Lysine décarboxylase Lysine-fer Culot violet Culot jaune Ornithine décarboxylase Milieu liquide sans peptone de Falkow Coloration violette Coloration jaune THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 74 3.2.5. Identification des souches présomptives de Vibrio par galeries API 20 E Des galeries API 20 E (BioMérieux, France) ont été utilisées pour confirmer l’identification des souches de Vibrio réalisée grâce aux tests morphologiques et biochimiques classiques. Ainsi, les souches ont été ensemencées dans les cupules ou les alvéoles des galeries API 20 E où sont dissous des substrats déshydratés. Les métabolites produits au cours des 24 heures d’incubation à 37°C ont été mis en évidence par des réactions colorées, spontanées ou révélées par addition de réactifs. La lecture de ces réactions a été effectuée à l’aide du tableau d’identification associé à la galerie, et le nom de la bactérie a été obtenu à l’aide du catalogue analytique et du logiciel APILAB. 3.2.6. Conservation des souches de Vibrio Un volume de 1 mL de culture de Vibrio dans le milieu TSB à 2 % de NaCl de 6 à 12 heures, et 0,1 mL de glycérol stérile ont été mis dans des cryotubes stériles et conservés dans un congélateur à - 20°C. Une identification des souches isolées a ensuite été effectuée par biologie moléculaire à l’Institut Pasteur de Paris. 3.2.7. Caractérisation moléculaire des espèces de Vibrio identifiées par la galerie API 20 E La caractérisation moléculaire des espèces de Vibrio identifiées par la galerie API 20 E s’est faite par la technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction) par une confirmation des espèces de Vibrio identifiées par la galerie API 20 E suivie de la recherche de gènes codant pour la toxine cholérique de V. cholerae (ctxA et ctxB) et les hémolysines thermostables directes et thermostables liées de V. parahaemolyticus (tdh et trh). La PCR a consisté à l’extraction de l’ADN bactérien, à l’amplification d’une séquence spécifique du gène recherché et à la révélation par électrophorèse sur gel d’agarose de l’amplicon. 3.2.7.1. Extraction de l’ADN bactérien Les souches de Vibrio conservées ont été cultivées sur gélose Marine Agar (DICO Laboratory) incubée à 37°C pendant 24 h. L’ADN a été extrait à partir des cultures de Vibrio de 24 heures avec le kit InstaGene Matrix (Bio Rad laboratories, Marnes La Coquette, France) selon les recommandations du fabricant. Pour ce faire, une anse pleine de colonies a été prélevée et triturée dans 1 mL d'eau physiologique tamponnée stérile préalablement distribuée dans les microtubes de 1,5 mL. Le mélange a été vortexé, puis THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 75 une centrifugation a été réalisée pendant 1 min à 12.000 trs / min et le surnageant a été éliminé. Ensuite, 200 µL de matrice InstaGene ont été ajoutés au culot et le tout a été mélangé par plusieurs pipetages avec un cône à large embout (cône bleu de 1000 µL) et incubé au bain-marie à 56º C pendant 30 min. Un vortexage à vitesse élevée du microtube a été effectué pendant 10 sec et le microtube a été placé dans un bloc chauffant à 100ºC pendant 8 min. Un autre vortexage du microtube à vitesse élevée pendant 10 sec suivi d’une centrifugation à 12.000 trs / min pendant 3 min ont été réalisés. Enfin 1 µL de surnageant contenant l’ADN bactérien a été utilisé pour 50 µL de réaction de PCR. 3.2.7.2. Confirmation de l’identification des espèces de Vibrio par PCR Dans la mesure où les souches des espèces V. alginolyticus et V. parahaemolyticus ne diffèrent que par l'utilisation du saccharose, les souches de V. alginolyticus sont donc systématiquement étudiées par la PCR spécifique de l'espèce V. parahaemolyticus. La confirmation des espèces de V. parahaemolyticus et de V. alginolyticus s’est donc faite par l’amplification des gènes r72H et toxR. L’amplification des gènes 16S/23S a servi à la confirmation des espèces de V. cholerae et celle des espèces de V. vulnificus a été réalisée par l’amplification du gène hly. Pour les différentes identifications, les amorces utilisées et les gènes recherchés sont regroupés dans le tableau VII. Le mélange réactionnel pour les PCR est constitué d’1 µL de matrice d'ADN dilué (concentration de 0,1 à 0,2 µg/50 µL) et d’un mix PCR d’un volume de 49 µL pour un mélange réactionnel final de 50 µL et un contrôle du mix PCR est réalisé en ajoutant 1 µL d’eau distillée stérile (H2O) au mix PCR. Pour vérifier l’amplification des différents gènes recherchés, une réaction d’électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % a été réalisée avec 10 µL de produit d’amplification en présence de 2 µL de solution de dépôt (0,07% de bleu de bromophénol, 20 % de Ficoll). Après migration en tampon Tris-borate-EDTA (TBE), les produits d’amplification sont mis en évidence après coloration par le Bromure d'Éthidium (BET), agent qui s'intercale entre les bases de l'ADN et qui est fluorescent en lumière Ultra- Violette (UV). Leur taille est déterminée par rapport à l’ADN témoin et avec les bandes d’un marqueur de poids moléculaire (TriDyeTM 100 bp DNA Ladder, Invitrogen) ayant migré dans les mêmes conditions. Ainsi pour l’amplification du géne r72H, le mix PCR était constitué de 30,5 µL d’eau distillée stérile (H2O), de 5 µL de tampon d’amplification 1X, de 3 µL de MgCl2 à 1,5 mM, de 5 µL de solution de désoxy ribonucléotide triphosphate (dNTPs) à 800 µM soit THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 76 200 µM finaux pour chaque dNTP, de 2,5 µL de chaque amorce à 1 µM pour chaque amorce et de 0,5 µL de Taq DNA polymérase à 2,5 U/50µL. Des contrôles internes sont également réalisés dont un témoin négatif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. alginolyticus et deux témoins posititifs avec respectivement 1 µL d’ADN d’une souche de V. parahaemolyticus ayant un produit d’amplification ‘‘R72H’’ de 320 paires de base (pb) et 1 µL d’ADN d’une souche de V. parahaemolyticus ayant un produit d’amplification ‘‘r72H’’ de 387 paires de base (pb). La PCR a été réalisée par une dénaturation initiale à 94°C pendant 10 min, suivie de 35 cycles d’amplification. Chaque cycle consiste en une dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 60°C pendant 1 min, une polymérisation à 72°C pendant 1 min. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 10 min a été réalisée. Concernant l’amplification du gène toxR, le mix PCR était constitué de 32,5 µL d’eau distillée stérile (H2O), de 5 µL de tampon d’amplification sans MgCl2, de 4 µL de MgCl2 à 2 mM, de 5 µL de solution de désoxy ribonucléotide triphosphate (dNTPs) à 800 µM soit 200 µM finaux pour chaque dNTP, de 1 µL de chaque amorce à 0.4 µM pour chaque amorce et de 0,5 µL de Taq DNA polymérase à 2,5 U/50µL. Des contrôles internes sont également réalisés dont un témoin négatif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. alginolyticus et deux témoins positifs avec chacun 1 µL d’ADN d’une souche de V. parahaemolyticus ayant un produit d’amplification ‘‘toxR ’’ de 368 paires de base (pb). La PCR a été réalisée par une dénaturation initiale à 96°C pendant 5 min, suivie de 20 cycles d’amplification. Chaque cycle consiste en une dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 63°C pendant 1,5 min, une polymérisation à 72°C pendant 1,5 min. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 7 min a été réalisée. Concernant l’amplification des gènes 16S/23S, le mix PCR était constitué de 31,5 µL d’eau distillée stérile (H2O), de 5 µL de tampon d’amplification 1X, de 5 µL de MgCl2 à 2,5 mM, de 5 µL de solution de désoxy ribonucléotide triphosphate (dNTPs) à 800 µM soit 200 µM finaux pour chaque dNTP, d’1 µL de chaque amorce à 0,4 µM et de 0,5 µL de Taq DNA polymérase à 2,5 U5/ 50 µL. Des contrôles internes sont également réalisés dont un témoin négatif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. mimicus et un témoin positif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. cholerae. La PCR a été réalisée par une dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min, suivie de 30 cycles d’amplification. Chaque cycle consiste en une dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 60°C pendant 1 min, une polymérisation à 72°C pendant 1 min. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 10 min a été réalisée. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 77 Enfin, pour l’amplification du gène hly, le mix PCR était constitué de 30,5 µL d’eau distillée stérile (H2O), de 5 µL de tampon d’amplification 1X , de 5 µL de MgCl2 à 2,5 mM, de 5 µL de solution de désoxy ribonucléotide triphosphate (dNTPs) à 800 mM soit 200 µM finaux pour chaque dNTP, de 1,5 µL de chaque amorce à 0,6 µM chacun et de 0,5 µL de Taq DNA polymérase à 2,5 U/50 µL. Des contrôles internes sont également réalisés dont un témoin négatif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. cholerae non-O1/non-O139 et un témoin positif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. vulnificus. La PCR a été réalisée par une dénaturation initiale à 94°C pendant 10 min, suivie de 40 cycles d’amplification. Chaque cycle consiste en une dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 68°C pendant 1 min, une polymérisation à 72°C pendant 1 min. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 10 min a été réalisée. 3.2.7.3. Sérotypage des souches de Vibrio cholerae Il a consisté en un test d'agglutination sur lame avec une culture de 24 h sur GNA. Un test en eau physiologique a été réalisé pour vérifier que les souches ne sont pas auto- agglutinables. Les souches ont été testées par la suite avec les sérums anti-O1 et anti-O 139. En présence d’agglutination avec le sérum anti-O1, la souche est une souche de Vibrio cholerae sérogroupe O1et en absence d’agglutination, la souche est une souche de Vibrio cholerae non O1. En présence d’agglutination avec le sérum anti-O139, la souche est une souche de Vibrio cholerae sérogroupe O139 et en absence d’agglutination, la souche est une souche de Vibrio cholerae non O139. 3.2.7.4. Recherche de facteurs de pathogénicité chez les espèces de V. parahaemolyticus, V. alginolyticus et V. cholerae Le pouvoir pathogène de Vibrio cholerae est lié à la présence des gènes ctxA et ctxB qui codent pour les sous-unités A et B de la toxine cholérique. Celui de V. parahaemolyticus est lié à la présence des gènes codant pour les hémolysines thermostables directes et thermostables liées (tdh et trh). Les souches de V. alginolyticus sont systématiquement étudiées pour la recherche des gènes tdh/trh du fait que les souches de V. parahaemolyticus et celles de V. alginolyticus ne diffèrent que par l'utilisation du saccharose. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 78 La recherche de facteur de pathogénicité chez ces trois espèces de Vibrio s’est faite par l’amplification des gènes (tdh et trh) et des gènes ctxA et ctxB. Les amorces utilisées et les gènes recherchés sont regroupés dans le tableau VII. Le mélange réactionnel pour les PCR est constitué aussi d’1 µL de matrice d'ADN dilué (concentration de 0,1 à 0,2 µg/50 µL) et d’un mix PCR d’un volume de 49 µL pour un mélange réactionnel final de 50 µL et un contrôle du mix PCR a aussi été réalisé en ajoutant 1 µL d’eau distillée stérile (H2O) au mix PCR. Pour l’amplification des gènes tdh et trh, le mix PCR était constitué de 28,5 µL d’eau distillée stérile (H2O), de 5 µL de tampon d’amplification 1X, de 5 µL de MgCl2 à 2,5 mM, de 5 µL de solution de désoxy ribonucléotide triphosphate (dNTPs) à 800 mM soit 200 µM finaux pour chaque dNTP, de 2,5 µL de chaque amorce à 1 µM pour chaque amorce et de 0,5 µL de Taq DNA polymérase à 2,5 U/50 µL. Des contrôles internes sont réalisés dont un témoin négatif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. parahaemolyticus tdh et trh négative et 1 µL d’ADN d’une souche de V. parahaemolyticus tdh et trh positive. La PCR a été réalisée par une dénaturation initiale à 94°C pendant 3 min, suivie de 30 cycles d’amplification. Chaque cycle consiste en une dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 58°C pendant 1 min et une polymérisation à 72°C pendant 1 min. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 10 min a été réalisée. Concernant l’amplification des gènes ctxA et ctxB, le mix PCR était constitué de 33,5 µL d’eau distillée stérile (H2O), de 5 µL de tampon d’amplification 1X, de 5 µL de solution de désoxy ribonucléotide triphosphate (dNTPs) soit 200 µM finaux pour chaque dNTP, de 2,5 µL de chaque amorce à 1 µM pour chaque primer et de 0,5 µL de Taq DNA polymérase à 2,5 U/50 µL. Des contrôles internes sont également réalisés dont un témoin négatif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. cholerae non-O1/non-O139 (ctxA négative) et un témoin positif avec 1 µL d’ADN d’une souche de V. cholerae O1 ou O139 (ctxA positive) ayant un produit d’amplification de 564 paires de base (pb). La PCR a été réalisée par une dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, suivie de 25 cycles d’amplification. Chaque cycle consiste en une dénaturation à 95°C pendant 1 min, une hybridation à 60°C pendant 1 min, une polymérisation à 72°C pendant 1 min. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 10 min a été réalisée. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 79 Tableau VII: Liste des amorces utilisées pour la caractérisation des souches de Vibrio Gènes cibles Amorces Séquence (5-3) Interprétation Taille des fragments amplifiés Références 16S/23S ISR VC-F VCM-R 5’-TTA AGC STT TTC RCT GAG AAT G- 3’ 5’-AGT CAC TTA ACC ATA CAA CCC G- 3’ Identification de l’espèce V. cholerae 295-310 pb Chun et al., 1999 hly VV-1 Vv-3 5’-CGC CGC TCA CTG GGG CAG TGG CTG- 3’ 5’-CCA GCC GTT AAC CGA AAC ACC CGC- 3’ Identification de l’espèce V. vulnificus 388 pb Brauns et al., 1991 r72H VP32 VP33 5’-CGA ATC CTT GAA CAT ACG CAG C- 3’ 5’-TGC GAA TTC GAT AGG GTG TTA ACC-3’ Identification de l’espèce V. parahaemolyticus 320-387 pb Lee et al., 1995 ; Robert-Pillot et. al., 2002 ToxR ToxR 4 ToxR 7 5’-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG- 3’ 5’-ATA CGA GTG GTT GCT GTC ATG- 3’ Identification de l’espèce V. parahaemolyticus 368 Kim et al., 1999 ctxA CTX2 CTX3 5’-CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G- 3’ 5’-CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC- 3’ Sous-unité A de la toxine cholérique 564 pb Fields et al., 1992 ctxB CTX7 CTX9B 5’-GGT TGC TTC TCA TCA TCG AAC CAC- 3’ 5’-GAT ACA CAT AAT AGA ATT AAG GAT G- 3’ Sous-unité B de la toxine cholérique 460 pb Olsvik et al., 1993 tdh L.tdh R.tdh 5’-GTA AAG GTC TCT GAC TTT TGG AC- 3’ 5’-TGG AAT AGA ACC TTC ATC TTC ACC- 3’ Hémolysine TDH de V. parahaemolyticus 269 pb Bej et al., 1999 trh L.trh R.trh 5’-TTG GCT TCG ATA TTT TCA GTA TCT- 3’ 5’CAT AAC AAA CAT ATG CCC ATT TCC G-3’ Hémolysine TRH de V. parahaemolyticus 500 pb Bej et al., 1999 pb : paires de bases THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 80 3.3. Recherche de métacercaires de Paragonimus et de métacercaires d’autres trématodes dans les crustacés La recherche de métacercaires de Paragonimus sp. et de métacercaires d’autres trématodes a été effectuée selon la technique utilisée par Aka et al. (2009). Cette technique a consisté à déterminer le sexe des crabes et à broyer les crustacés dans un moulin à viande. Le broyat a par la suite été mis dans une bouteille en plastique contenant un litre d’eau de robinet. L’ensemble a été soumis à une agitation manuelle pendant 3 minutes à la température de la pièce et le mélange a été mis à sédimenter pendant 10 minutes. Cette opération a été répétée plusieurs fois jusqu'à ce que le surnageant devienne clair. Le sédiment a alors été prélevé pour être examiné au microscope optique entre lame et lamelle à l’objectif x 10 puis x 40 pour rechercher les métacercaires qui sont des kystes sphériques. Les métacercaires retrouvées dans les crustacés ont été conservées au congélateur à – 20° C dans des cryotubes contenant de l’éthanol à 70° selon la technique utilisée par Doanh et al. (2007). 4. Détermination du risque d’infection à Vibrio lié à la consommation des crustacés par l’évaluation participative du risque 4.1. Modèle utilisé pour l’évaluation du risque Le modèle que nous avons utilisé pour évaluer le risque d’infection à Vibrio lié à la consommation des crustacés est l’évaluation participative du risque (Duraiappah et al., 2005). Ce modèle est basé sur celui du Codex Alimentarius relatif à l’évaluation de risque (Crepet, 2007), auquel nous avons intégré la participation des consommateurs de crustacés par la réalisation de focus group discussions ou groupes de discussions et l’enquête ménage réalisée à Abidjan sur la consommation des crustacés. Nous avons par ailleurs construit un arbre de défaillance (Figure 26) qui est un modèle schématique (Vose, 2005) qui nous aide à représenter de façon synthétique l’ensemble des combinaisons des événements qui peuvent conduire à la contraction d’ infections à Vibrio liées à la consommation des crustacés. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 81 Présence de Vibrio et de crustacés dans la Lagune Ebrié Crustacés provenant de la lagune et contaminés par les Vibrio Crustacés contaminés par Vibrio dans le panier de vente au marché Crustacés contaminés par Vibrio en contact dans le panier de la ménagère avec les légumes Contamination croisée entre crustacés et les légumes dans le panier de la ménagère Contamination croisée entre crustacés contaminés et crustacés non contaminés dans le panier de vente des crustacés Consommation de crustacés bien cuits Consommation de crustacés mal cuits Consommation de légumes consommés Infections à Vibrio Evénement initial Ou Evénement final Figure 26 : Arbre de défaillance sur le risque de contraction des infections à Vibrio au niveau des ménages THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 82 4.2. Réalisation des « focus groups discussions » ou groupes de discussions Sept groupes de discussions avec 6 ménagères et consommatrices de crustacés par groupe de discussion ont été réalisés à Abidjan. Au total 42 femmes ont participé à ces focus group qui ont eu lieu à Abobo-Baoulé (Abobo), Abobodoumé (Attécoubé), Marcory, Koumassi, Port-Bouët, Williamsville et Yopougon-Kouté. Les quartiers ont été choisis de façon aléatoire comme ceux qui ont servis à la réalisation de l’enquête ménage à Abidjan sur la consommation des crustacés. Avant la tenue de l’entretien avec les ménagères, l’ensemble des participants a été présenté (enquêteurs et interrogés). Les raisons de l’étude ont été données, la permission pour l’enregistrement a été demandée et obtenue, la liste des participants a été faite, les participants ont été placés de sorte à pouvoir faire l’enregistrement puis la tenue de l’interview a été expliquée. Le guide d’entretien était constitué de 13 questions (Annexe VII). 4.3. Evaluation du risque 4.3.1. Identification du danger Pour identifier le danger (Vibrio) présent dans les crabes et les crevettes vendus sur les marchés d’Abidjan et de Dabou, nous avons d’abord recherché dans la littérature les germes pathogènes susceptibles de contaminer les crustacés. Ensuite, en prenant en compte les données existantes dans la littérature et en considérant le fait que ces germes peuvent avoir un effet néfaste sur la santé des consommateurs de crustacés, nous avons retenu les Vibrio comme germes associés aux crustacés pour lesquels il est intéressant de mener une évaluation des risques. 4.3.2. Evaluation de l’exposition au risque Pour évaluer l’exposition au risque de consommation de crustacés contaminés par des souches de Vibrio au moment de l’achat, nous avons utilisé la modélisation stochastique (Pouillot et al., 2002). Cette méthode qui a nécessité des distributions de probabilités pour représenter soit la variabilité, soit l’incertitude sur un paramètre, a permis de construire un modèle afin de déterminer la probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de l'achat (Nauta, 2001). Le modèle global 1 qui nous a permis de déterminer cette probabilité journalière a été donc construit à partir d’une succession de modèles partiels, les variables de sortie à une étape servant potentiellement de variables d’entrée pour les étapes suivantes. Les différents modules, constituant les étapes du modèle, et qui établissent les relations entre THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 83 variables d’entrée et de sortie, ont été construits à partir des données sur la proportion des consommateurs de crustacés, sur le taux journalier de consommation des crustacés, sur la proportion des consommateurs de crabes, sur la proportion des consommateurs de crevettes, sur la prévalence des Vibrio dans les crabes et sur la prévalence des Vibrio dans les crevettes. La formule 10 présente le modèle global 1 et les modèles partiels qui le composent. Modèle 1: P = P1 T1 (P2P3 + P4P5) Formule (10) P: Probabilité de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat P1 : Proportion des consommateurs de crustacés T1 : Taux journalier de consommation des crustacés P2 : Proportion des consommateurs des crabes P3: Prévalence des Vibrio dans les crabes P4: Proportion des consommateurs des crevettes P5: Prévalence des Vibrio dans les crevettes P est le modèle global et P1, T1, P2, P3, P4 et P5 sont les modèles partiels. Une distribution Béta a été associée à 5 variables du modèle 1 qui sont la proportion des consommateurs de crustacés, la proportion des consommateurs de crabes, la proportion des consommateurs de crevettes, la prévalence des Vibrio dans les crabes et la prévalence des Vibrio dans les crevettes. En fait la distribution Béta est utilisée pour remplacer ces cinq variables pour avoir des distributions de probabilités puisque nous utilisons la méthode probabiliste. La distribution Béta est utilisée pour estimer la probabilité de succès p pour n indépendants et identiques essais lesquels produisent s succès. Les paramètres de chacune des 5 distributions Béta ont été calculés avec la formule 11 P = Beta (s+1, n-s+1) Formule (11) s+1 et n-s+1 sont les paramètres de la distribution Béta s est le nombre de succès et n est le nombre d’échantillons THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 84 Avec les données du taux journalier de consommation des crustacés, nous avons réalisé à l’aide du logiciel Modelrisk 4.0, un bootstrap non paramétrique qui est un outil qui permet de calculer numériquement l’incertitude d’un ensemble de données de mesures par plusieurs reprises des résultats au hasard parmi l’ensemble des données. La probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de l'achat a donc été déterminée à l’aide du logiciel Modelrisk 4.0 qui nous a permis de réaliser 5000 itérations (simulations) en faisant appel à un échantillonnage aléatoire de chaque distribution Béta et du bootstrap non paramétrique dans le modèle 1.  Analyse de sensibilité du modèle 1 Une analyse de sensibilité du modèle 1 a été réalisée à l’aide du logiciel Modelrisk 4.0 pour savoir si l’un des paramètres ci-après influence la probabilité de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de l'achat. Ces paramètres sont la proportion des consommateurs de crustacés, la proportion des consommateurs de crabes, la proportion des consommateurs de crevettes, la prévalence des Vibrio dans les crabes, le taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage et la prévalence des Vibrio dans les crevettes. 4.3.3. Evaluation du rapport dose-effet et la caractérisation du risque L’évaluation du rapport dose-effet qui est la probabilité d’infection à Vibrio liée à la consommation des crustacés et la caractérisation du risque qui la probabilité annuelle d'infection liée à de multiples expositions à Vibrio n’ont pas pu être déterminées parce que nous n’avons pas pu déterminer la dose de Vibrio ingérée par les consommateurs de crustacés. En effet, nous n’avons pas pu déterminer la charge résiduelle de Vibrio dans les crustacés après leur cuisson. 5. Recherche de la paragonimose chez les patients des CAT et chez les élèves des deux écoles primaires de Dabou 5.1. Echantillonnage des patients et des élèves 5.1.1. Calcul de la taille des échantillons de patients et des élèves Le calcul de la taille des échantillons de patients enquêtés au niveau des centres antituberculeux de Treichville et d’Adjamé a été fait en se basant sur les travaux réalisés par Aka et al. (2008 b) qui ont trouvé une prévalence de 4 % de la paragonimose humaine. THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 85 Une erreur de 5 %, une précision de 5 % et une puissance de 80 % sur cette prévalence nécessitera un échantillon d’au moins 57 patients calculé par la formule (7). Le calcul de la taille des échantillons d'élèves enquêtés au niveau des villages d’Allaba et de N’Gatty s’est aussi basé sur les travaux réalisés par Aka et al. (2008 b) sur la paragonimose humaine et la formule (7). Vu la faible prévalence de la paragonimose et le taux de réponse, nous avons décidé d’inclure d’une part tous les patients qui allaient se présenter au centre antituberculeux pendant la période d’étude et d’autre part tous les élèves dont les parents donneront leur accord pour la participation de leur enfants à l’étude. 5.1.2. Critères d’inclusion des patients et des élèves Les personnes suspectées d’être atteintes de tuberculose et d’âge supérieur ou égal à 5 ans, fréquentant les CAT de Treichville et d’Adjamé au moment de la réalisation de l’étude ont été retenues. Les parents des patients mineurs et les patients majeurs ont donné leur consentement éclairé écrit ou oral. Les élèves du CE1 au CM2 des écoles de N’Gatty et d’Allaba ont été inclus dans l’étude après l’obtention du consentement éclairé écrit de leurs parents. 5.1.3. Critères de non inclusion des patients et des élèves Les patients des CAT âgés de moins de cinq ans et les élèves du CP1 et du CP2 des deux écoles primaires n’ont pas été inclus dans l’étude à cause de leur très jeune âge qui ne leur permet pas de répondre à notre questionnaire. 5.1.4. Prélèvement des échantillons des patients et des élèves et collecte de données sur leur consommation de crustacés Avec l’accord des directeurs des deux centres antituberculeux et l’aide de certains de leurs collaborateurs, chaque patient, après obtention de son consentement éclairé verbal ou écrit (Annexe VIII), a reçu un numéro d'identification unique (ID), trois contenants en plastique stérile pour recueillir ses expectorations et un autre contenant pour la collecte de ses selles. Chaque patient a été invité à apporter ses trois échantillons de crachats à raison d’un le premier jour et deux autres le deuxième jour, avec son échantillon de selles. Tous les échantillons ont été prélevés de mars à juin 2009. Chaque patient a été invité par ailleurs à répondre à un questionnaire (Annexe IX) le premier jour de l’étude. Le questionnaire administré par notre équipe se composait de trois parties. La première THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 86 section contenait des informations sur la démographie (âge et sexe) et les variables socio- économiques (type de maison habitée, nombre de personnes dans la maison). La seconde portait sur les symptômes de la paragonimose humaine (toux de plus de trois semaines, expectorations sanglantes, douleurs thoraciques). La troisième section portait sur les facteurs de risque de la paragonimose (habitudes alimentaires et culinaires liées à la consommation de crabes et de la viande de porc et l’approvisionnement en eau). Concernant les élèves, nous avons sollicité et obtenu l’accord de l’inspectrice de l’enseignement primaire de Dabou et des directeurs des écoles primaires d’Allaba et de N’Gatty. Nous avons donné à chaque élève, après l’obtention du consentement écrit de ses parents (Annexe VIII), un contenant en plastique pour la collecte de ses selles le jour de l’étude et chaque élève a reçu un numéro d'identification unique (ID). Les élèves ont été invités par la suite à répondre individuellement à notre questionnaire sur leur consommation de crustacés. Le questionnaire a été administré par notre équipe à laquuelle nous avons associé les enseigants. Tous les échantillons ont été prélevés en mai 2010. Le questionnaire soumis aux élèves se composait également de trois parties (Annexe X). 5.2. Recherche du Bacille de Koch (BK) dans les crachats des patients La recherche de BK s’est effectuée aux laboratoires de bactériologie des centres antituberculeux de Treichville et d’Adjamé sur les trois échantillons de crachats recueillis chez chaque patient. Cette recherche a consisté à étaler les expectorations des patients sur des lames porte objets, à fixer les frottis grâce à la flamme d’un bec Bunsen, à les colorer avec l’auramine et à examiner les lames au microscope à fluorescence avec le grossissement 400 (objectif 40x, oculaire 10x). Les BK apparaissent jaunes fluorescents sur fond rouge (Biofarma, 2003). 5.3. Recherche d’œufs de Paragonimus et d’autres parasites dans les crachats et les selles des patients  Crachats La recherche d’œufs de Paragonimus a été réalisée sur les prélèvements de crachats au laboratoire de parasitologie de l’UFR des Sciences médicales d’Abidjan. Cette recherche s’est effectuée par étalement du culot des crachats après centrifugation. Pour obtenir une expectoration fluide, chaque échantillon a été dilué dans une solution de soude à 4 % (1 volume d’expectoration pour trois volumes de NaOH). Le diluât a été ensuite placé dans un tube conique pendant 20 minutes avant d’être centrifugé dans une centrifugeuse à 1500 THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 87 tours/minute pendant 3 minutes. Le culot résultant de cette dernière opération a été enfin récupéré pour être examiné au microscope optique entre lame et lamelle à l’objectif x 10 puis x 40 (Aka et al., 2008 b). Les éventuels œufs de parasites retrouvés sont ainsi identifiés grâce aux fiches techniques de l’OMS (Annexe XI).  Selles L’échantillon de selles recueilli chez chaque patient le deuxième jour de récolte des crachats a été utilisé pour rechercher des œufs de Paragonimus, des œufs de trématodes autres que Paragonimus et d’autres parasites pathogènes pour l’homme. La technique de Ritchie a été utilisée pour cette recherche. Ainsi 1 g de selles a été dilué dans de l’eau formolée à 10 %, le tout a été alors tamisé et de l’éther a été ajouté au tiers. Le mélange, après agitation, est centrifugé à une vitesse de 1500 trs/min pendant 3 minutes. Le culot est examiné au microscope avec les grossissements 10 fois et 40 fois (Ritchie, 1948). Les protozoaires et les helminthes observés grâce à cette technique de concentration, ont été identifiés grâce aux fiches techniques de l’OMS (Annexe XI), en se basant sur les caractères morphologiques et morphométriques de leurs œufs ou de leurs kystes (OMS, 1982). 5.4. Recherche d’œufs de Paragonimus et d’autres parasites pathogènes dans les selles des élèves La recherche d’œufs de Paragonimus et d’autres helminthes dans les selles des élèves a été réalisée à l’aide de la technique de Kato-Katz (Katz et al., 1972). Ensuite un prélèvement d’un gramme de selles a été conservé dans 10 mL d’une solution de SAF (acide formique acétate de sodium) (Marti et Escher, 1990) afin de rechercher aussi par la méthode d’éther-concentration des œufs de Paragonimus, d’autres helminthes et des protozoaires intestinaux (Utzinger et al., 2010). La méthode de Kato-Katz a consisté d’abord à réaliser un frottis épais à partir de 41,7 mg de matières fécales de chaque échantillon de selles prélevées à l’aide d’une spatule et déposées dans un moule placé sur une lame porte-objet. Ensuite, à recouvrir les selles par un rectangle de cellophane de 2 x 3 cm préalablement immergé pendant 24 heures dans une solution constituée de 100 mL de glycérine, 100 mL d’eau distillée et 1 mL de vert de malachite à 3 %. La préparation a été par la suite retournée et écrasée sur du papier journal jusqu’à ce que les matières fécales se soient étalées de façon uniforme entre lame et cellophane et laissée à l’air ambiant pendant 30 à 40 min pour éclaircissement. Les œufs de THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 88 Paragonimus et des autres helminthes ont été recherchés au microscope au grossissement x100. Les helminthes ont été identifiés grâce aux fiches techniques de l’OMS (Annexe XI), en se basant sur les caractères morphologiques et morphométriques de leurs œufs (OMS, 1982). Après la technique de Kato-Katz, les selles qui avaient été conservées dans du SAF, ont été analysées par la méthode d’éther-concentration. Cette technique a consisté d’abord à écraser et à homogénéiser les selles contenues dans la solution de SAF de 10 mL avant de transvaser le tout dans un entonnoir avec une compresse. Ensuite, le filtrat a été recueilli dans un tube conique puis centrifugé à 1500 trs/min pendant 1 minute. Le surnageant a été rejeté puis 7 mL de 0,85 % NaCl et 3 mL de diéthyl éther ont été ajoutés au culot. Le tube conique a été bouché et le tout a été homogénéisé avant d’être centrifugé à nouveau à 2000 trs/min pendant 5 minutes (Utzinger et al., 2010). Le surnageant a été rejeté et les helminthes et les protozoaires ont été recherchés dans le culot au microscope optique entre lame et lamelle à l’objectif x 10, puis x 40. Ils ont été identifiés grâce aux fiches techniques de l’OMS (Annexe XI), en se basant sur les caractères morphologiques et morphométriques de leurs œufs ou de leurs kystes (OMS, 1982). 6. Analyse statistique La double saisie des données a été effectuée et elles ont été analysées avec le logiciel SPSS.10 (IBM Corporation ; Somers, NY, USA). Six bases de données ont été créées sur, l’enquête ménage à Abidjan, l’enquête auprès des vendeuses, la recherche de Vibrio dans les crustacés, la recherche de métacercaires de Paragonimus dans les crustacés, la recherche de paragonimose chez les patients des CAT et la recherche de paragonimose chez les élèves. Les pourcentages et les prévalences ont été déterminés en rapportant l’effectif considéré à l’effectif total. Quatre modèles linéaires généralisés de type binomial ont été ajustés avec le logiciel R 2.10.1 pour savoir si la contamination des crustacés par les Vibrio était liée à leur genre (modèle 2), à leur marché d’achat (modèle 3), à leur sexe (modèle 4) et à leur origine de provenance (modèle 5). Modèle 2 < -glm (CONTAMINATION~GENRE, famille=binomiale) Modèle 2 : log (p/1-p) = α2 Genre + β2 Modèle 3 <- glm (CONTAMINATION~MARCHE, famille=binomiale) Modèle 3 : log (p/1-p) = α3 Marché + β3 Modèle 4 <- glm (CONTAMINATION~SEXE, famille=binomiale) Modèle 4 : log (p/1-p) = α4 Sexe + β4 THESE DE DOCTORAT Deuxième partie : matériel et méthodes TRAORE Sylvain Gnamien 89 Modèle 5 < -glm (CONTAMINATION~ORIGINE, famille=binomiale) Modèle 5 : log (p/1-p) = α5 Sexe + β5 α2, α3, α4 et α5 sont des coefficients β2, β3, β4 et β5 sont des constantes Trois autres modèles linéaires généralisés de type binomial ont été ajustés avec le logiciel R 2.10.1 pour savoir si l’infestation des crustacés par les métacercaires de trématodes était liée à leur marché d’achat (modèle 6), à leur origine de provenance (modèle 7) et à leur sexe (modèle 8). Modèle 6 <- glm (INFESTATION~MARCHE, famille=binomiale) Modèle 6: log (p/1-p) = α6 Genre + β6 Modèle 7 < -glm (INFESTATION~ORIGINE, famille=binomiale) Modèle 7: log (p/1-p) = α7 Genre + β7 Modèle 8 <- glm (INFESTATION~SEXE, famille=binomiale) Modèle 8: log (p/1-p) = α8 Genre + β8 α6, α7 et α8 sont des coefficients β6, β7 et β8 sont des constantes. Le Bootstrap non paramétrique, les distributions Béta que nous avons utilisées dans le modèle 1 et les itérations (simulations) de notre modèle ont été réalisés grâce au logiciel ModelRisk 4.0. Les discussions de groupe ont été transcrites sur Word puis transférées sur le logiciel MAXQDA. Des codes ont été élaborés et transférées sur Word pour les analyses. Le test de khi deux a été utilisé pour voir si l’infection des patients des CAT par le bacille tuberculeux était liée à leur sexe. Ce test a été également utilisé pour voir si l’infestation des patients des deux centres antituberculeux et des deux écoles primaires par les protozoaires et les helminthes intestinaux était liée à leur sexe. Les intervalles de confiance ont été calculés avec le logiciel STATA. 10. Le risque relatif (RR) qui permet d’identifier les patients de la paragonimose parmi ceux qui consultent pour la tuberculose a été calculé à l’aide de la formule suivante : RR = {a/(a+b)}/{c/(c+d)} Formule (14) où “a” est le nombre de patients atteints à la fois de la paragonimose et de la tuberculose, “b” le nombre de patients atteints uniquement de la tuberculose, “c” le nombre de patients atteints uniquement de la paragonimose et “d” le nombre de patients ne souffrant d’aucune de ces deux affections. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 90 TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 91 I. Potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés aux traitements des crustacés au cours de la vente et à la consommation des crustacés au niveau des ménages 1. Résultats 1.1. Potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés à la consommation des crustacés 1.1.1. Description des ménages et de leurs habitudes et techniques culinaires Dans l'enquête auprès des 120 ménages, 96,7 % des répondants étaient des femmes contre 3,3 % qui étaient des hommes. Le niveau d'instruction de la plupart des répondants était l'école secondaire (38,3 %). Le nombre moyen de personnes dans les ménages était de 7,5 avec un intervalle allant d’une personne à 24 personnes par ménage. La plupart des répondants vivaient dans des maisons en bandes. Quatre vingt neuf virgule deux pourcents (89,2 %) des ménages déclaraient consommer les crustacés sous la forme bouillie en sauce. Le temps de cuisson des crustacés dans les ménages variait de 5 minutes à plus d’une heure. Dans 64,2 % des ménages, les crustacés étaient cuits pendant plus d’une heure tandis que 21,7 %, 2,5 %, 2,5 % et 6,8 % des ménages les cuisaient respectivement à des temps compris entre 45 et 60 min, entre 30 et 45 min, entre 15 et 30 min, et entre 5 et 15 min. La moitié d’un crustacé est consommée par personne dans 43,3 % des ménages. L’enquête a montré que 11,7 % des ménages mangeaient les crustacés tous les jours (7 fois par semaine) contre 45,8 % des ménages qui les consommaient occasionnellement et 42,5 % qui les mangeaient rarement (Tableau VIII). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 92 Tableau VIII : Caractéristiques socio-démographiques des ménages et leurs habitudes et techniques culinaires (n = 120) Caractéristiques Effectifs (%) Sexe du répondant Femme 116 (96,7) Homme 4 (3,3) Niveau d’étude du répondant Pas d’études 31 (25,8) Ecole primaire 30 (25,0) Ecole secondaire 46 (38,3) Université 13 (10,8) Habitat du ménage Maison en bandes 50 (41,7) Cour commune 37 (30,8) Villa 27 (22,5) Immeuble 5 (4,2) Maison en bois 1 (0,8) Forme de cuisson des crustacés Bouillie 107 (89,2) Frite 13 (10,8) Fréquence de consommation des crustacés Tous les jours (7 fois par semaine) 14 (11,7) Occasionnellement (~une fois chaque mois) 55 (45,8) Rarement (~une fois par an) 51 (42,5) Quantité de crustacés consommée par personne La moitié d’un crabe plat (39 g) 52 (43,3) Un crabe plat entier (78 g) 7 (5,8) Deux crabes plats (156 g) 6 (5) Trois crabes plats (234 g) 4 (3,3) Un tiers d’un kg de crevettes (333,3 g) 3 (2,5) Un crabe poilu (106 g) 1 (0,8) Cinq crevettes (85 g) 1 (0,8) Temps de cuisson des crustacés 5-15 min 8 (6,8) 15-30 min 3 (2,5) 30-45 min 3 (2,5) 45-60 min 26 (21,7) Plus de 60 min 77 (64,2) Inconnu 3 (2,5) THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 93 1.1.2. Crustacés les plus consommés au niveau des ménages Tous les ménages enquêtés avaient au moins consommé une fois des crustacés. L’enquête a permis de constater que 114 ménages sur les 120 enquêtés consommaient plus les crabes (crabes plats et crabes poilus) et que 6 ménages sur les 120 enquêtés consommaient plus les crevettes. Les crabes du genre Callinectes (crabes plats) étaient plus consommés dans 89,2 % des ménages, avec 82,5 % de ménages les achetant vivants et 6,7 % les achetant morts. Les crabes Cardisoma (crabes poilus) et les petites crevettes étaient consommés respectivement par 5,8 % et 5 % des ménages (Figure 27). 1.1.3. Contact entre les crustacés et les autres aliments dans le panier de la ménagère A la question de savoir s’il y a un contact direct entre les crustacés et les autres aliments dans le panier de la ménagère, 45,8 % des ménages ont répondu par l’affirmative tandis que 54,2 % disaient le contraire. 1. 2. Symptômes d’intoxication alimentaire observés au sein des ménages suite à la consommation des crustacés L’eau d’adduction (fournie par le réseau national de distribution d’eau) était la principale source d’approvisionnement en eau des ménages (99,2 %). De tous les ménages enquêtés, seulement 7,5 % déclaraient avoir eu des symptômes d’intoxication alimentaire suite à la consommation de crustacés. Aucun des ménages interrogés ne connaissait la paragonimose humaine mais 98,3 % d’entre eux connaissaient le choléra. Le tableau IX donne le pourcentage de ménages connaissant la paragonimose et le choléra, mais aussi le pourcentage de ménages ayant eu des symptômes d’intoxication alimentaires liés à la consommation des crustacés. 1.3. Potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés aux traitements des crustacés 1.3.1. Mode de traitement des crustacés avant leur vente La majorité des vendeuses (91,2 %) ne rinçaient pas les crustacés avant de les vendre pendant que 8,8% les rinçaient. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 94 1.3.2. Durée de vente des crustacés Parmi les vendeuses de crustacés interrogées, 50,9 % vendaient leurs crustacés d’un même lot (panier de crustacés) en un jour, 40,3 % les vendaient en deux jours, 5,3 % et 3,5 % les vendaient respectivement en trois et quatre jours. La figure 28 montre le pourcentage des vendeuses de crustacés en fonction du délai de vente. 1.3.3. Contenant de vente des crustacés La plupart des vendeuses vendaient les crustacés dans les cuvettes et les paniers. En effet, 40,3 % des vendeuses les vendaient dans des cuvettes et 38,6 % les vendaient dans des paniers. La figure 29 montre le pourcentage des vendeuses de crustacés en fonction du mode de stockage des crustacés. 1.3.4. Eléments en contact avec les crustacés lors de leur vente Soixante dix virgule deux pourcent (70,2 %) des vendeuses vendaient leur crustacés sans glace ni feuilles, 19,3 % les vendaient avec des feuilles qu’elles utilisaient pour les couvrir et 10,5 % des vendeuses les vendaient avec de la glace pour les conserver. La figure 30 montre le pourcentage des vendeuses de crustacés mettant des éléments en contact avec les crustacés lors de la vente. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 95 Figure 27: Crustacés les plus consommés par les ménages Figure 28: Pourcentage des vendeuses de crustacés en fonction du délai de vente Pourcentage des ménages Type de crustacés consommés Durée de vente des crustacés (jour) Pourcentage des vendeuses THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 96 Tableau IX: Connaissance du choléra et de la paragonimose par les ménages et symptômes d’intoxication alimentaire liés à la consommation des crustacés au sein de ces ménages (n = 120) Caractéristiques Effectifs (%) Source d’approvisionnement en eau Eau de robinet (fournie par le réseau national) 119 (99,2) Eau vendue dans la rue 1 (0,8) Connaissance du choléra Non 2 (1,6) Oui 118 (98,3) Connaissance de la paragonimose Non 120 (100) Oui 0 (0) Symptômes d’intoxication alimentaire liés à la consommation de crustacés Aucun symptôme 111 (92,5) Présence de symptômes 9 (7,5) Diarrhée 3 (2,5) Maux de ventre 3 (2,5) Angine 1 (0,8) Allergie 1 (0,8) Maux d’oreille 1 (0,8) THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 97 Figure 29: Pourcentage des vendeuses de crustacés en fonction du mode de stockage des crustacés . Figure 30: Pourcentage des vendeuses de crustacés mettant des éléments en contact avec les crustacés lors de la vente Eléments en contact avec les crustacés Pourcentage des vendeuses Pourcentage des vendeuses Contenants de vente des crustacés THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 98 2. Discussion L’enquête auprès des ménages a révélé que les crabes et les crevettes sont consommés par la plupart des ménages et que des symptômes d’intoxication alimentaire suite à la consommation des crustacés, ont été parfois observés. Ces symptômes (diarrhée, maux d'estomac et douleurs abdominales) sont peu spécifiques, ils peuvent être causés par des souches de Vibrio parahaemolyticus et de Vibrio cholerae non O1; non O139 mais aussi par un certain nombre de pathogènes autres que les souches de Vibrio. Ces symptômes pourraient également être dus à la consommation d’aliments autres que les crustacés. Différentes étapes ont été identifiées comme particulièrement importantes dans l'exposition des ménages à des infections à Vibrio liées à la consommation des crustacés, i) la phase de post-récolte (conditions de stockage), ii) le contact des crustacés avec les autres aliments dans le panier de la ménagère, par rapport à une contamination croisée, iii) les pratiques culinaires dans les ménages, par rapport à un report de contamination, iv) la fréquence de consommation et la quantité de crustacés consommée. En ce qui concerne la première étape, nous avons observé que le traitement des crustacés et leur méthode de vente sur les marchés locaux étaient propices à la croissance des Vibrio. La plupart des vendeuses (70,2 %), vendaient les crustacés sans glace, ce qui suppose un risque de multiplication des bactéries dont des Vibrio dans ces crustacés. Les crevettes, vendues mortes, devraient être maintenues en permanence en présence de glace lors de leur vente, mais ce n’était pas ce que nous avions observé sur les marchés étudiés. Il est concevable de noter que si, pendant la journée, la température augmente après la fonte des morceaux de glace, il en résulterait une croissance des microorganismes déjà présents dans les crustacés. Dans leur étude sur la qualité des crabes plats appartenant à l’espèce Callinectes amnicola, Koussémon et al. (2008) avaient fait remarquer que la température de vente des fruits de mer sur les marchés locaux (entre 25,5 et 26,5 ° C) favoriserait la prolifération des germes d'altération dans les crustacés. Par ailleurs, la majorité des vendeuses (91,2 %) ne rinçaient pas les crustacés avant de les vendre, pourtant le rinçage des crustacés pourrait contribuer à une réduction du niveau de contamination des crustacés. Pour ce qui est du contact des crustacés avec les autres aliments dans le panier de la ménagère, 45,8 % des ménages affirment que lors de l’achat des crustacés, ils sont en contact avec les autres aliments dans le panier. Ce contact entre les crustacés et les autres aliments pourrait entraîner une contamination de certains légumes (qui sont consommés crus) par des germes dont les Vibrio. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 99 Concernant les pratiques culinaires, 7,5 % des ménages ont déclaré avoir eu des symptômes d’intoxication alimentaire après consommation des crustacés. Ce faible pourcentage est susceptible d'être expliqué par le fait que la plupart des ménages (96,7 %) consomment les crustacés dans des sauces, ce qui nécessite un long temps de cuisson à une température élevée susceptible de détruire les Vibrio (Cohen et Karib, 2007). Les infections à Vibrio sont généralement acquises par la consommation de crustacés contaminés crus ou peu cuits. Les symptômes liés à la consommation des crustacés sous forme bouillie en sauce, signalée au niveau des ménages, pourraient être expliqués par un report de contamination des crustacés après la cuisson. Ces symptômes pourraient aussi être expliqués par une contamination croisée entre les crustacés et les légumes ou être simplement dus à la consommation d’autres aliments. Le temps de cuisson est un point critique dans la prévention des infections à Vibrio, comme l’ont effectivement démontré Blake et al. (1980). Selon ces auteurs, certaines souches de V. cholerae 01 survivraient jusqu'à 8 min à l'ébullition et jusqu'à 25 min à l'étuvage dans des crabes naturellement contaminés. Enfin, concernant la fréquence de consommation et la quantité de crustacés consommée, 11,7 % des ménages ont signalé une consommation quotidienne de crustacés et 43,3 % consomment la moitié d’un crustacé par jour. Cette fréquence et cette quantité de consommation des crustacés au niveau des ménages sont de potentiels facteurs de risque d'infection à Vibrio. Conclusion partielle Les conditions et la durée de vente des crustacés, le contact des crustacés avec les autres aliments dans le panier de certaines ménagères, la consommation journalière des crustacés par certains ménages, la courte durée de cuisson des crustacés et la consommation de la moitié d’un crabe plat par personne au sein de certains ménages sont de potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés à la consommation des crustacés. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 100 II. Présence de Vibrio dans les crustacés vendus sur les principaux marchés d’Abidjan et de Dabou 1. Résultats 1.1. Prévalence de la contamination des crustacés par Vibrio Au total, 322 échantillons de crustacés (150 crabes plats, 152 lots de crevettes et 20 crabes poilus), ont été prélevés pour la recherche de Vibrio. Ainsi, sur les 322 échantillons de crustacés analysés, 25 étaient contaminés par Vibrio, soit une prévalence de 7,8 %. L’analyse bactériologique a révélé une contamination par Vibrio des crustacés appartenant aux genres Penaeus (petites crevettes) et Callinectes (crabes plats) avec des prévalences respectives de 14,3 % et 6,0 %. Le tableau X donne le pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction de leur genre. Un modèle linéaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 au niveau de la variable genre (modèle 2) en prenant en compte uniquement les genres Callinectes et Penaeus, a permis de montrer que la contamination des crustacés par Vibrio est liée au genre Penaeus (P <0,005). 1.2. Contamination des crustacés par Vibrio en fonction du marché de prélèvement Les échantillons contaminés par Vibrio proviennent de tous les 7 marchés de prélèvement avec des prévalences de contamination comprises entre 2,3 % et 15,6 %. Le tableau XI donne le pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction de leur marché de prélèvement. Le modèle linéaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 au niveau de la variable marché de prélèvement (modèle 3) a permis de montrer que la contamination des crustacés n’est pas liée au marché de prélèvement des crustacés (P > 0,005). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 101 Tableau X: Pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction du genre IC: intervalle de confiance Tableau XI: Pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction du marché de prélèvement IC : intervalle de confiance Genres de crustacés Nombre d’échantillons analysés Nombre d’échantillons contaminés Pourcentage de contamination (%) [95 % IC] Crevettes Penaeus 112 16 14,3 [8,4-22,2] Crabes Callinectes 150 9 6,0 [2,8-11,1] Crevettes Macrobrachium 40 0 0 Crabes Cardisoma 20 0 0 Total 322 25 7,8 [5,1-11,2] Villes Marchés Nombre d’échantillons analysés Nombre d’échantillons contaminés Pourcentage de contamination (%) [95 % IC] Abidjan Treichville 45 7 15,6 [6,5-29,5] Port Bouët 29 3 10,3 [2,2-27,4] Koumassi 50 5 10,0 [3,3-21,8] Adjamé 34 3 8,8 [1,8-23,7] Siporex 75 2 2,7 [0,3-9,3] Marcory 44 1 2,3 [0,1-12,0] Dabou Dabou 45 4 8,9 [2,5-21,2] Total 322 25 7,8 [5,1-11,2] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 102 1.3. Température moyenne de prélèvement des crustacés et charge en Vibrio La température moyenne des crustacés au moment de leur prélèvement variait de 14, 8 °C (crevettes) à 26, 8°C (crabes plats). Le nombre moyen de Vibrio dans les crevettes Penaeus et les crabes Callinectes était respectivement de 106 UFC/g (6,27 log UFC/g) et 106 UFC/g (6,26 log UFC/g). Le tableau XII donne la température moyenne de prélèvement des crustacés et leur charge en Vibrio. 1.4. Contamination des crustacés par Vibrio en fonction du sexe des crabes plats La contamination des crustacés en fonction de leur sexe a été examinée uniquement avec les crabes plats (Callinectes) parce qu’aucun crabe poilu (Cardisoma armatum) n’a été retrouvé contaminé par Vibrio et que le sexe des échantillons de crevette n’a pas pu être déterminé du fait que notre échantillon de crevette est constitué en moyenne de 10 crevettes (mâle et femelle). Ainsi, sur les 150 (80 mâles et 70 femelles) crabes plats analysés, 6 mâles étaient contaminés (prévalence 7,5 %) et 3 femelles étaient aussi contaminées (prévalence de 4,3 %). Le tableau XIII donne la prévalence de contamination des crabes plats par Vibrio en fonction de leur sexe. Le modèle linéaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 au niveau de la variable sexe (modèle 4) a permis de montrer que la contamination des crabes plats n’est pas liée au sexe. 1.5. Contamination des crustacés par Vibrio selon la provenance Les échantillons contaminés par Vibrio proviennent de cinq localités (Blokauss à Abidjan, Bassam, Grand Lahou, Dabou et Adiaké) avec des prévalences de contamination comprises entre 6,8 % et 33,3 %. Le tableau XIV donne le pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction de la provenance. Le modèle linéaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 au niveau de la variable origine (modèle 5) en prenant en compte uniquement les cinq localités de provenance des crustacés contaminés, a permis de montrer que la contamination des crustacés n’est pas liée à ces 5 localités (P > 0,005). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 103 1.6. Espèces de Vibrio identifiées des crustacés par PCR La PCR a permis d’identifier 25 souches de Vibrio constituées par les espèces V. cholerae non O1; non O139, V. parahaemolyticus et V. alginolyticus qui était l’espèce prédominante. Le tableau XV donne le résultat de l’identification des espèces de Vibrio par PCR. Les figures 31 et 33 montrent respectivement un profil d’identification de V.cholerae par la recherche du gène 16S/32S et un profil d’identification de V. parahaemolyticus par la recherche du gène toxR. 1.7. Espèces de Vibrio identifiées en fonction du type de crustacés Sur les 25 souches de Vibrio isolées des crabes plats appartenant au genre Callinectes et des petites crevettes appartenant au genre Penaeus, 40 % appartiennent à l’espèce V. alginolyticus, 36 % à l’espèce V. parahaemolyticus et 24 % à l’espèce V. cholerae non O1; non O139. Le tableau XVI donne le pourcentage d’identification des Vibrio en fonction du type de crustacés. 1.8. Absence de gènes de virulence dans les espèces de Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus et Vibrio parahaemolyticus identifiées par PCR Les gènes codant pour des facteurs de virulence majeure, la toxine cholérique de V. cholerae (ctxA et ctxB) et les hémolysines thermostables directes et thermostables liées de V. parahaemolyticus (tdh et trh) n'ont pas été détectés dans les souches de V. cholerae et V. parahaemolyticus que nous avons caractérisées par PCR. La recherche des gènes (tdh et trh) chez V. alginolyticus s’est avérée aussi négative. Le tableau XVII donne le résultat de la recherche de gènes de virulence chez V. cholerae, V. alginolyticus et V. parahaemolyticus. Les figures 32 et 34 montrent respectivement un profil de recherche des gènes de pathogénicité ctxA et ctxB pour V. cholerae et un profil de recherche des gènes tdh et trh de V. parahaemolyticus. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 104 Tableau XII : Température moyenne de prélèvement et charge des crustacés en Vibrio * Température moyenne des crustacés dans le contenant de vente ** Facteur de multiplication des bactéries d’altération dans les crustacés au prélèvement Tableau XIII: Prévalence de contamination des crabes plats par Vibrio en fonction de leur sexe IC : intervalle de confiance Type de crustacés Température* moyenne (°C) Facteur de multiplication** Nombre moyen de Vibrio (log UFC/g) Crabes Callinectes 26,8 ± 1,6 14 6,26 ± 0,50 Crabes Cardisoma 26,4 ± 0,7 13 0 Crevettes Macrobrachium 14,8 ± 6,8 6 0 Crevettes Penaeus 14,8 ± 6,8 6 6,27 ± 0,98 Sexe Effectif de crabes analysés Effectif de crabes infectés Pourcentage de crabes plats infectés (%) [95 % IC] Mâle 80 6 7,5 [2,8-15,6] Femelle 70 3 4,3 [2,3-15,8] Total 150 9 6,0 [3,7-12,7] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 105 Tableau XIV: Pourcentage de contamination des crustacés par Vibrio en fonction de la provenance IC: intervalle de confiance Provenances Nombre d’échantillons analysés Nombre d’échantillons contaminés Pourcentage de contamination (%)[95 % IC] Blokauss 3 1 33,3 [0,84- 90,6] Bassam 6 1 16,7 [0,4- 64,12] Grand Lahou 57 6 10,5 [3,9-21,5] Dabou 156 14 9,0 [6,4-16,8] Adiaké 44 3 6,8 [3,8-24,5] Koumassi 24 0 0,0 Jacqueville 23 0 0,0 Tiassalé 3 0 0,0 Toukouzou 6 0 0,0 Total 322 25 7,8 [6,4;13] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 106 Tableau XV: Liste des espèces de Vibrio identifiées par PCR  +: présence du gène  -: absence du gène Numéros de souches Gènes cibles recherchés par PCR Espèces identifiées r72H toxR hly 16S/32S 1 - - V. alginolyticus 2 - - V. alginolyticus 3 - + V. cholerae non O1; non O139 4 - + V. cholerae non O1; non O139 5 - - V. alginolyticus 6 - - V. alginolyticus 7 + + V. parahaemolyticus 8 + + V. parahaemolyticus 9 + - V. parahaemolyticus 10 + + V. parahaemolyticus 11 - - V. alginolyticus 12 - - V. alginolyticus 13 + + V. parahaemolyticus 14 + + V. parahaemolyticus 15 + + V. parahaemolyticus 16 - - V. alginolyticus 17 - - V. alginolyticus 18 + + V. parahaemolyticus 19 - + V. cholerae non O1; non O139 20 - + V. cholerae non O1; non O139 21 - + V. cholerae non O1; non O139 22 - - V. alginolyticus 23 - - V. alginolyticus 24 - + V. cholerae non O1; non O139 25 + + V. parahaemolyticus THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 107 Tableau XVI: Pourcentage d’identification des Vibrio en fonction du type de crustacés Espèces de Vibrio isolées Nombre de souches isolées des crabes Callinectes (%) Nombre de souches isolées des crevettes Penaeus (%) Total de souches isolées (%) V. alginolyticus 6 (60) 4 (40) 10 (40) V. parahaemolyticus 2 (22,2) 7 (77,8) 9 (36) V. cholerae non O1; non O139 1(16,7) 5 (83,3) 6 (24) Total 9 (36) 16 (64) 25 (100) THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 108 Tableau XVII: Espèces de Vibrio ne possédant pas les gènes codant pour la toxine cholérique et pour les hémolysines  -: absence du gène Espèces identifiées par PCR Gènes de virulence recherchés par PCR tdh trh ctxA ctxB V. alginolyticus - - V. alginolyticus - - V. cholerae non O1; non O139 - - V. cholerae non O1; non O139 - - V. alginolyticus - - V. alginolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. alginolyticus - - V. alginolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. alginolyticus - - V. alginolyticus - - V. parahaemolyticus - - V. cholerae non O1; non O139 - - V. cholerae non O1; non O139 - - V. cholerae non O1; non O139 - - V. alginolyticus - - V. alginolyticus - - V. cholerae non O1; non O139 - - V. parahaemolyticus - - THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 109 Figure 31: Confirmation de l’identification de 4 souches de Vibrio cholerae par la recherche du gène 16S/23S M : Marqueur de poids moléculaire (100 pb DNA Ladder, Invitrogen) ; E : Eau; T+: Témoin positif (Vibrio cholerae contenant le gène 16S/23S) ; T- : Témoin négatif (V. mimicus ne contenant pas le gène 16S/23S) ; 1, 2, 3 et 4: 4 souches de Vibrio cholerae identifiées par galerie API et caractérisées par PCR Figure 32: Profil montrant l’absence des gènes de pathogénicité ctxA et ctxB chez 4 souches de Vibrio cholerae M: Marqueur de poids moléculaire (100 pb DNA Ladder, Invitrogen) ; E : Eau ; T+: Témoin positif (Vibrio cholerae contenant le gène ctxA) ; T+: Témoin positif (Vibrio cholerae contenant le gène ctxB); T-: Témoin négatif (V. mimicus ne contenant pas les gènes ctxA et ctxB); 1, 2, 3 et 4: 4 souches de Vibrio cholerae caractérisées par PCR THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 110 Figure 33: Confirmation de l’identification de V. parahaemolyticus par la recherche du gène toxR M: Marqueur de poids moléculaire (100 pb DNA Ladder, Invitrogen) ; E : Eau; T1+: Témoins positif (V. parahaemolyticus contenant le gène toxR), T2+: Témoin positif (V. parahaemolyticus contenant le gène toxR) ; T-: Témoin négatif (V. alginolyticus ne contenant pas le gène toxR) ; 1: 1 souche de Vibrio parahaemolyticus identifiée par galerie API et caractérisée par PCR Figure 34: Profil montrant l’absence des gènes de pathogénicité tdh et trh chez une souche de Vibrio parahaemolyticus M : Marqueur de poids moléculaire (100 pb DNA Ladder, Invitrogen) ; E : Eau ; T1+ : Témoin positif (V. parahaemolyticus contenant les gènes tdh et trh), T2+ : Témoin négatif (V. parahaemolyticus ne contenant pas les gènes tdh et trh ); 1: espèce de Vibrio parahaemolyticus caractérisée par PCR THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 111 2. Discussion La recherche de Vibrio dans les 322 échantillons de crustacés (crabes et crevettes) analysés a révélé une prévalence de 7,8 % de Vibrio avec des prévalences de 14,3 % et de 6,0 % de Vibrio respectivement chez les crevettes Peneaus et chez les crabes Callinectes. La prévalence des crevettes est plus élevée que celle observée dans une étude effectuée à Casablanca, au Maroc qui était de 5,7 % (Cohen et Karib, 2007). Les 25 souches de Vibrio identifiées comprennent trois espèces dont V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, et V. cholerae non O1 ; non O139 avec une prédominance de V. alginolyticus (40% de prévalence). Les gènes codant pour des facteurs de virulence majeure, la toxine cholérique de V. cholerae (ctxA et ctxB) et les hémolysines thermostables directes et thermostables liées de V. parahaemolyticus (tdh et trh) n'ont pas été détectés dans les souches isolées au cours de notre étude. Cohen et Karib (2007) ont aussi identifié 25 souches de Vibrio dans les produits de pêche dont V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, et V. cholerae non O1 ; non O139 avec une prédominance de V. alginolyticus beaucoup plus élevée (72% de prévalence). Ils n’ont également pas détecté les gènes codant pour la toxine cholérique de V. cholerae et les gènes codant pour les hémolysines thermostables de V. parahaemolyticus. Tiekoura et al. (2010), après avoir caractérisé 30 souches de V. cholerae non O1 ; non O139 à partir des eaux de la lagune de Grand Lahou (Côte d’Ivoire) par PCR ont trouvé que ces souches étaient aussi négatives pour le gène ctxA. La présence de V. cholerae dans les échantillons de crustacés analysés pourrait être expliquée par la capacité de cette espèce à adhérer et à coloniser les coquilles des crustacés; ce qui facilite sa survie en milieu aquatique (Castro-Rosas et Escartin, 2002). La présence de V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, et V. cholerae non O1; non O139 dans les crustacés suppose que ces espèces sont également présentes à l’état libre dans la lagune Ebrié qui est un lieu de pêche des crustacés analysés. En effet, selon Farama et al. (2008), la concentration initiale en vibrions dans les aliments lors de la récolte serait reliée à la quantité de vibrions dans l’eau. Plusieurs auteurs ont signalé la présence de Vibrio dans le milieu marin et dans les eaux estuariennes côtières de Côte d'Ivoire (Kouassi et al., 1992 ; Tiekoura et al., 2010). Dans les étangs du centre piscicole de Layo en Côte d’Ivoire, des V. cholerae non O1; non O139 ont été isolés du tube digestif d’un alevin de silure appartenant à l’espèce Heteobranchus longifilis (Adingra, 1997). Par ailleurs, notre étude montre que les bactéries d’altération se multiplient dans les crabes plats 14 fois plus à la température de 26,8°C que si ces crabes plats étaient THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 112 conservés à 0°C, et 13 fois plus dans les crabes poilus à la température de 26,4 °C que si ces crabes poilus étaient conservés à 0°C. Dans leur étude sur la qualité des crabes plats appartenant à l’espèce Callinectes amnicola, Koussémon et al. (2008) avaient fait remarquer que la température de vente des fruits de mer sur les marchés locaux (entre 25,5 et 26,5 ° C) favoriserait la prolifération des germes d'altération dans les crustacés. Bien que les gènes codant pour la toxine cholérique n'aient pas été détectés dans nos d'échantillons, nous pouvons affirmer sur la base de nos résultats, que la consommation crue ou insuffisamment cuits des crustacés vendus sur les marchés d’Abidjan et de Dabou, ne représenterait pas de risque de contraction du choléra. Cependant, nous ne pouvons pas conclure que les espèces de V. cholerae non O1; non O139 que nous avons isolées, ne sont pas potentiellement pathogènes et ne représentent pas un risque pour la santé humaine. La bactérie Vibrio cholerae non O1; non O139 a été associée principalement à des cas sporadiques de diarrhées et d’infections extra-intestinales en Inde (Bhanumathi et al., 2003). Toute personne au contact de la mer ou consommant ses produits crus ou peu cuits est susceptible de développer une infection à vibrions, mais les personnes immunodéprimées représentent la population la plus sensible (Farama et al., 2008). En effet, environ 70 % des souches V. cholerae non-O1/non-O139 possèdent une capsule polysaccharidique, constituée entièrement de sucres qui augmente la capacité des bactéries à résister à la phagocytose et à provoquer des septicémies chez les sujets immunodéprimés (Zhang et Austin, 2005; Cohen et al., 2007 ; Saka et al., 2008). Conclusion partielle La recherche de Vibrio dans les 322 crustacés (crabes et crevettes) a révélé une prévalence de Vibrio de 7,8 %. L’identification par PCR des 25 souches de Vibrio isolées des crustacés a montré que les crustacés étaient contaminés par V. alginolyticus, V. parahaemolyticus et V. cholerae non O1 ; non O139, avec une prédominance de V. alginolyticus (40% de prévalence). La recherche dans les souches de V. parahaemolyticus, V alginolyticus et de V. cholerae non O1/non O139 que nous avons isolées, de gènes codant pour des facteurs de virulence majeure, la toxine cholérique de V. cholerae (ctxA et ctxB) et les hémolysines thermostables directes et thermostables liées de V. parahaemolyticus (tdh et trh) s’est avérée négative. Même si aucun des facteurs de virulence recherchés n’a été trouvé dans cette étude, il est utile de maintenir la vigilance en contrôlant régulièrement les souches de V. parahaemolyticus et de V. cholerae isolées des fruits et mer et de la lagune Ebrié. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 113 III: Présence de métacercaires de trématodes dans les crustacés vendus sur les principaux marchés d’Abidjan et de Dabou 1. Résultats 1.1. Prévalence de l’infestation des crustacés par les métacercaires de trématodes Au total, 272 échantillons de crustacés (221 crabes plats, 18 crabes poilus et 33 lots de crevettes), ont été prélevés pour la recherche de métacercaires de Paragonimus mais la présente étude n’a pas permis d’en trouver. Elle a cependant montré que seulement les crabes étaient infestés par des métacercaires de trématodes autres que Paragonimus. La figure 35 montre la photographie d’une métacercaire de trématode retrouvée dans un crabe. Aucune métacercaire de trématodes n’a été retrouvée chez les crevettes. Au total, sur les 272 crustacés analysés, 32 crabes étaient infestés par des métacercaires de trématodes, soit une prévalence de 11,8 %. Les prévalences d’infestation des crabes Callinectes et de ceux appartenant au genre Cardisoma sont respectivement de 13,6 % et de 11,1 %. Le tableau XVIII donne le pourcentage d’infestation des crustacés par les trématodes en fonction de leur genre. 1.2. Contamination des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction du marché de prélèvement Les échantillons contaminés par les métacercaires de trématodes proviennent de tous les marchés de prélèvement avec des prévalences comprises entre 3,4 % et 25 %. Le tableau XIX donne le pourcentage d’infestation des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction du marché de prélèvement Un modèle linéaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 (modèle 6) a permis de montrer que la contamination des crabes est liée de façon significative (P < 0,05) aux marchés de Port-Bouët, de Siporex et de Treichville (respectivement P = 0,04, P = 0,02 et P = 0,03). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 114 Figure 35: Photographie d’une métacercaire de trématode retrouvée dans un crabe Tableau XVIII: Pourcentage d’infestation des crustacés par les trématodes en fonction de leur genre IC: intervalle de confiance Genres de crustacés Nombre d’échantillons analysés Nombre d’échantillons contaminés Pourcentage de contamination (%) [95 % IC] Crabes Callinectes 221 30 13,6 [9,3-18, 8] Crabes Cardisoma 18 2 11,1 [1,4-34,7] Crevettes Penaeus 30 0 0,0 Crevettes Macrobrachium 3 0 0,0 Total 272 32 11, 8 [8,2-16,2] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 115 Tableau XIX: Pourcentage d’infestation des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction du marché de prélèvement IC : intervalle de confiance Villes Marchés Nombre d’échantillons analysés Nombre d’échantillons contaminés Pourcentage de contamination (%) [95 % IC] Abidjan Adjamé 32 8 25,0 [11,5-43,4] Marcory 43 7 16,3 [6,8-30,7] Koumassi 49 5 10,2 [3,4-22,2] Treichville 45 3 6,7 [1,3-18,3] Siporex 41 2 4,9 [0,5-16,5] Port bouët 29 1 3,4 [0,1-17,7] Dabou Dabou 33 6 18,2 [6,9-35,5] Total 272 32 11,8 [8,2-16,2] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 116 1.3. Contamination des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction de la provenance Les crustacés obtenus pour la recherche de Paragonimus proviennent des localités d’Abidjan (Koumassi et Blokauss), Adiaké, Bassam, Dabou, Grand Lahou, Jacqueville, Tiassalé et Toukouzou. Les échantillons contaminés par des métacercaires de trématodes proviennent de six zones (Adiaké, Bassam, Dabou, Grand Lahou, Jacqueville et Koumassi) avec des prévalences comprises entre 5,4% et 33,3%. Le tableau XX donne la prévalence d’infestation des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction de leur provenance. Un modèle linaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 (modèle 7) en prenant en compte uniquement les six localités de provenance des crustacés infestés, a permis de montrer que la localité de Dabou est liée de façon significative (P < 0,05) à l’infestation des crustacés (P=0,03). 1.4. Contamination des crabes par des métacercaires de trématodes en fonction du sexe La contamination des crustacés en fonction de leur sexe a été examinée uniquement avec les crabes plats (Callinectes) et les crabes poilus (Cardisoma armatum) parce qu’aucune crevette n’a été retrouvée infestée par des métacercaires de trématodes. Ainsi, sur les 18 (8 mâles et 10 femelles) crabes poilus analysés, un mâle (12,5%) et une femelle (10%) étaient infestés par des métacercaires de trématodes. Par ailleurs, sur les 221 (90 mâles et 131 femelles) crabes plats analysés, 12 mâles (prévalence 13,3 %) et 18 femelles étaient infestés (prévalence de 13,7 %). Le tableau XXI donne la prévalence des métacercaires de trématodes en fonction du sexe des crabes plats. Un modèle linéaire généralisé de type binomial ajusté avec le logiciel R 2.10.1 (modèle 8) en prenant en compte uniquement les crabes plats, a permis de montrer que leur infestation n’est pas liée à leur sexe. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 117 Tableau XX: Prévalence d’infestation des crustacés par des métacercaires de trématodes en fonction de leur provenance IC: intervalle de confiance Tableau XXI: Prévalence des métacercaires de trématodes en fonction du sexe des crabes plats IC: intervalle de confiance Localités Effectif de crustacés analysés Effectif de crustacés infestés Pourcentage de crustacés infestés (%) [95 % IC] Bassam 3 1 33, 3 [0,8; 90,6] Dabou 117 21 17,9 [11,5; 26,1] Koumassi 8 1 12, 5 [0,3; 52,6] Jacqueville 32 3 9,4 [1,9;25] Adiaké 63 4 6, 3 [1,7;15,4] Grand Lahou 37 2 5, 4 [0,6; 18,2] Toukouzou 6 0 0, 0 Tiassalé 3 0 0, 0 Blokauss 3 0 0, 0 Total 272 32 11, 8 [8,1;16,2] Sexe Effectif de crabes analysés Effectif de crabes infestés Pourcentage de crabes plats infestés (%) [95 % IC] Mâle 90 12 13, 3 [7,1-22,1] Femelle 131 18 13,7 [8,4- 20,8] Total 221 30 13,6 [9,3-18,8] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 118 2. Discussion Les métacercaires de Paragonimus n’ont pas été décelées dans les 272 crustacés analysés. Aucune métacercaire de trématode n’a été trouvée dans les crevettes Penaeus et celles appartenant au genre Macrobrachium. L’absence de métacercaires dans les crevettes pourrait s’expliquer par le faible nombre de crevettes que nous avons examiné. En effet, du fait de leur indisponibilité par moment sur les marchés, nous n’avons pu analyser que 30 Penaeus et 3 Macrobrachium. L’étude a cependant révèle la présence de métacercaires de trématodes autres que Paragonimus dans 2 crabes appartenant à l’espèce Cardisoma armatum sur les 18 analysés (prévalence 11,1 %) et dans 30 crabes appartenant au genre Callinectes sur les 221 examinés (prévalence 13,6 %). Aka et al. (1999) ont trouvé aussi des métacercaires de trématodes dans 28 crabes appartenant à l’espèce Callinectes marginatus sur 176 crabes qu’ils ont étudiés (prévalence 16%) au Bénin. L’absence de métacercaires de Paragonimus dans les crustacés analysés pourrait s’expliquer par l’absence de foyers endémiques de la paragonimose humaine dans ces deux villes. En effet, dans le cycle biologique de ce parasite, les œufs excrétés par les malades atteints par la paragonimose qui se retrouvent dans le milieu aquatique par les expectorations ou les selles des malades, deviennent plus tard des larves de Paragonimus qui s’enkysteront dans des crustacés sous forme de métacercaires. Il va s’en dire que dans une localité donnée, si la paragonimose humaine n’existe pas, aucun œuf de Paragonimus ne sera excrété et par conséquent aucun crustacé ne sera infesté par des métacercaires de Paragonimus. Nos résultats diffèrent de ceux obtenus par Aka et al. (2008 a et 2009) en Côte d’Ivoire. En effet, Aka et al. (2008 a) ont trouvé à Divo des métacercaires spécifiques de Paragonimus chez six crabes C. marginatus (crabes d’eaux saumâtres) sur les 34 examinés. Les charges parasitaires se distribuaient entre deux et 35 métacercaires par crabe tandis que le diamètre moyen des kystes était de 302 µm. De plus, Aka et al. (2009) ont trouvé des métacercaires de Paragonimus de petite taille (de 277 à 323 µm en moyenne), dans trois crabes sur les 15 appartenant à l’espèce C. marginatus qu’ils ont capturés autour de l’île de Lauzoua (au sud-ouest de la Côte d’Ivoire). Il existe une diversité et un nombre élevé d’espèces de trématodes. En effet, environ 6000 espèces de trématodes ont été décrites et ces espèces comprennent les douves du foie, du poumon, et de l’intestin, collectivement connues sous le nom de trématodes THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 119 d'origine alimentaire (Whitfield, 1982 ; Keiser et Utzinger, 2009; Sithiathaworn et al., 2009). Conclusion partielle La présente étude n’a pas permis de trouver des métacercaires de Paragonimus dans les 272 crustacés que nous avons analysés mais elle a permis de trouver des métacercaires d’autres trématodes dans 2 crabes appartenant à l’espèce Cardisoma armatum sur les 18 analysés (prévalence 11,1 %) et dans 30 crabes appartenant au genre Callinectes sur les 221 examinés (prévalence 13,6 %). Les crustacés provenant de la localité de Dabou devraient faire l’objet d’une surveillance particulière parce que cette localité est liée de façon significative à l’infestation des crabes par des métacercaires de trématodes. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 120 IV. Risque d’infection à Vibrio lié à la consommation des crustacés 1. Résultats 1.1. Evaluation du risque 1.1.1. Identification du danger Les données recueillies dans la littérature soulignent que certaines espèces de Vibrio constituent un danger pour les consommateurs des produits de la pêche et en particulier des crustacés et des mollusques bivalves. Ce danger (Vibrio) est confirmé par les résultats de l’analyse bactériologique des crustacés vendus à Abidjan et à Dabou. En effet, sur les 322 échantillons de crabes et de crevettes analysés, 25 étaient contaminés par Vibrio, soit une prévalence de 7,8 %. Les 25 crabes et crevettes étaient contaminés par des souches de V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, et V. cholerae non O1/non O139. Selon les ménagères qui ont participé au focus goups discussions, la consommation de crustacés insuffisamment fumés et achetés déjà morts sur le marché peut donner des diarrhées et aussi d’autres maladies. En effet, selon une participante du focus group que nous avons réalisé à Yopougon Kouté, les crustacés morts peuvent donner une indigestion « J'aime plus vivant parce que mort là quand c'est mort là, souvent c'est pourrit, ça peut faire couler le ventre ». Selon une autre particiapnte du focus group réalisé à Abobodoumé, les crevettes peuvent rendre malade quand elles ne sont pas bien fumées « On n’utilise pas assez les crevettes parce que le problème des crevettes là, c’est délicat. Quand ce n’est pas bien fumé, souvent ça rend malade ». Selon une autre participante d’un focus group réalisé à Marcory, les crustacés sont toxiques et ils peuvent donner des indigestions « C’est toxique, ça peut donner des indigestions même. C’est des trucs même quand tu viens là, la première de chose, tu prends ton éponge, tu laves, tu précuits ça avant de préparer ». De plus les ménagères ont des stratégies propres à elles pour conserver les crabes quand ils ne sont pas consommés le même jour. Cette stratégie varie d’une famille à une autre selon les moyens financiers. Par exemple une participante d’un focus group réalisé à Williamsville utilise le chauffage pour conserver les crustacés « Puisque je n’ai pas de frigo donc je chauffe pour garder et le lendemain je prépare ». 1.1.2. Evaluation de l’exposition Selon les femmes avec lesquelles nous avons fait la discussion de groupe, le temps que met la cuisson des crustacés varie selon les ménagères. Selon une participante du focus group réalisé à Williamsville, la durée de cuisson des crustacés depend de la sauce préparée. La sauce graine met plus de temps au feu par rapport à la sauce claire ou la THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 121 aubergine « Je n’ai jamais chronométré le temps. En tout cas au moins 2 heures sinon ça dure au feu hein ». Selon une autre participante d’un focus group réalisé à Treichville, le temps de friture des crutacés est estimé à 5 minutes « La grillade ne dure pas, 10 minutes même c’est trop, 5 minutes parce que c’est sur le gaz. Quand c’est gros, je fais précuire ça légèrement ». Certaines familles consomment rarement les crabes pour des raisons économiques, par exemple une participante du focus group réalisé à Port bouët consomme les crustacés rarement « Pas toujours, c’est par occasion. C’est les jours j’ai envie de manger que j’achète »; D’autres les consomment tous les jours pour des raisons de préférence et gustative. En effet, une autre participante du focus group discussion réalisé à Port bouët, consomme régulièrement les crustacés « Chaque fois. Quand je ne mange pas crabes, je ne suis pas à l’aise. Quand c’est la sauce tomate, je grille ». Par ailleurs, l’exposition des consommateurs de crustacés au danger Vibrio a été déterminée grâce au calcul de la probabilité journalière de consommation des crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat. Ce calcul a été effectué à partir des données du taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage avec lesquelles nous avons réalisé un bootstrap non paramétrique et à partir des paramètres de la distribution béta pour 5 données essentielles: la proportion des consommateurs de crustacés, la proportion des consommateurs de crabes, la proportion des consommateurs de crevettes, la prévalence des Vibrio dans les crabes et la prévalence de Vibrio dans les crevettes. La distribution Béta a été utilisée pour quantifier notre incertitude sur les vraies valeurs de la proportion des consommateurs de crustacés, la proportion des consommateurs de crabes, la proportion des consommateurs de crevettes, la prévalence des Vibrio dans les crabes et la prévalence des Vibrio dans les crevettes. Le bootstrap non paramétrique est un outil qui permet de calculer numériquement l’incertitude d’un ensemble de données de mesures par plusieurs reprises des résultats au hasard parmi l’ensemble des données. 1.1.2.1. Paramètres de la distribution Béta pour les variables du modèle 1 La recherche de Vibrio dans les crustacés a montré que 9 crabes sur les 170 analysés étaient contaminés par Vibrio (5,3%) et 16 crevettes sur les 152 analysées étaient également contaminées par Vibrio (10,5%). Ces données ont permis donc de calculer les paramètres de la distribution Béta (10;162) de la prévalence de Vibrio dans les crabes, et les paramètres de la distribution Béta (17;137) de la prévalence de Vibrio dans les crevettes grâce à la formule 10. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 122 L’enquête ménage à Abidjan a permis de constater que 114 ménages sur les 120 enquêtés consomment les crabes (95%) et que 6 ménages sur les 120 enquêtés consomment les crevettes (5%). Ces données ont aussi permis de calculer les paramètres de la distribution Béta (115;7) de la proportion de ménages consommateurs de crabes et les paramètres de la distribution Béta (7;115) de la proportion de ménages consommateurs de crevettes grâce à la formule 10. Le pourcentage des ménages consommateurs de crustacés était de 96% (29 ménages sur 30 interrogés consomment les crustacés). Ces données ont permis de calculer les paramètres de la distribution Béta (30;2) de la proportion des ménages consommateurs de crustacés grâce à la formule 10. Le tableau XXII donne l’ensemble des distributions associées aux variables du modèle 1. 1.1.2.2. Probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat La probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat a été déterminé par stimulations Monte Carlo à l’aide du logiciel ModelRisk 4.0 grâce au modèle 1 que nous avons construit à partir de la distribution Béta (10;162) de la prévalence de Vibrio dans les crabes, de la distribution Beta (17;137) de la prévalence de Vibrio dans les crevettes, de la distribution Béta (115;7) de la proportion de ménages consommateurs de crabes, de la distribution Béta (7;115) de la proportion de ménages consommateurs de crevettes, de la distribution Béta (30;2) de la proportion des ménages consommateurs de crustacés et du bootstrap non paramétrique réalisé avec les données du taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage. La probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat est de 0,013. Le tableau XXIII donne la probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat. 1.1.2.3. Analyse de la sensibilité du modèle 1 Une analyse de sensibilité du modèle 1 a été réalisée à l’aide du logiciel Modelrisk 4.0 pour savoir si l’un des paramètres associé à la consommation des crustacés influence la probabilité de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur l'achat. Ces paramètres sont la proportion des consommateurs de crustacés, la proportion des consommateurs de crabes, la proportion des consommateurs de crevettes, la prévalence THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 123 des Vibrio dans les crabes, le taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage et la prévalence des Vibrio dans les crevettes. La figure 36 montre que la prévalence des Vibrio dans les crabes, suivie du taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage influencent la probabilité de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat. En effet, ces deux variables du modèle 1 présentent les largeurs de bandes les plus élevées. Tableau XXII: Distributions associées aux variables du modèle 1 Tableau XXIII: Probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat Variables Distribution Proportion des consommateurs de crustacés (P1) Beta (30;2) Taux journalier moyen de consommation des crustacés par personne et par ménage (T1) Bootstrap non paramétrique Proportion des consommateurs des crabes (P2) Beta (115;7) Prévalence des Vibrio dans les crabes (P3) Beta (10;162) Proportion des consommateurs des crevettes (P4) Beta (7;115) Prévalence des Vibrio dans les crevettes (P5) Beta (17;137) Paramètres Valeurs Moyenne journalière 0,013 Minimum 0,003 Maximum 0,032 Ecart-type 0,004 THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 124 Figure 36: Analyse de sensibilité du modèle 11 pour savoir quel paramètre influence la probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio sp. au moment de leur achat 6) Prévalence de Vibrio dans les crabes 5) Taux estimé de consommation journalière moyenne de crustacés 4) Proportion de la population à Abidjan consommatrice de crustacés 3) Proportion des consommateurs de crevettes 2) Proportion de la population consommatrice de crabes 1) Prévalence de Vibrio dans les crevettes Probabilités Variables du modèle 1 THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 125 2. Discussion La probabilité journalière de consommation des crustacés contaminés par Vibrio sp. au moment de leur achat est de 0,013. Ce résultat pourrait s’expliquer par le fait que 45,8 % des ménages consomment les crustacés occasionnellement et 42,5 %, les consomment rarement selon l’enquête ménage que nous avons réalisée à Abidjan. Ce résultat pourrait aussi s’expliquer par la faible prévalence de contamination des crustacés qui est de 7,8 %. L’analyse de sensibilité du modèle 1 explique mieux ce résultat en montrant que la prévalence de Vibrio dans les crabes et le taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage qui est lui-même lié à la fréquence journalière de consommation des crustacés influencent la probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio sp. au moment de leur l'achat. Nous n’avons pas pu estimer le risque d’infection à Vibrio non cholérique lié à la consommation des crustacés parce nous avons travaillé sur des crustacés frais donc il n’a pas été possible pour nous de déterminer la dose de Vibrio effectivement ingérée par les consommateurs. Compte tenu de la faible probabilité journalière de consommation des crustacés contaminés par Vibrio sp. au moment de leur achat, le risque de contraction d’infection à Vibrio non cholérique serait probablement faible. En effet, selon l’enquête ménage que nous avons réalisée à Abidjan, 89,2 % des ménages interrogés consomment les crustacés bouillis (en sauce). Les échanges que nous avons eu avec les ménagères par les discussions de groupe nous ont permis de nous rendre compte qu’elle font ainsi bien cuire les crustacés pour éviter d’exposer leur famille à d’éventuelles infections liées à une cuisson insuffisante. Cependant, même si la majorité des ménages fait bien cuire les crustacés avant de les consommer le même jour, le risque d’infections à Vibrio cholerae non O1 ; non O 139, Vibrio parahaemolyticus et Vibro alginolyticus peut subsister lorsque le délai entre la cuisson et la consommation est élevé et si la cuisson n’a pas détruit tous les vibrions. Une étude réalisée par Farama et al. (2008) a, en effet, montré que les vibrions restants après la cuisson des crustacés peuvent se multiplier à nouveau si le produit n’est pas conservé à une température inférieure à 4 °C. Dans une étude menée dans des restaurants de la Nouvelle-Orléans, la bactérie V. parahaemolyticus a été retrouvée dans 50 % des échantillons d’huîtres cuites, 67 % des échantillons de crevettes bouillies et 33 % des échantillons de salades de crabe (FDA, 2005). Des cas d’infections dues à l’ingestion d’écrevisses cuites ont eu lieu aussi aux États-Unis (Bean et al., 1998). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 126 Des gastro-entérites aiguës, des infections cutanées, des otites, des conjonctivites et des infections extra-intestinales avec des signes de maladie invasive, sont des symptômes que pourraient avoir les consommateurs de crustacés. En effet, la bactérie Vibrio parahaemolyticus est connue comme une cause majeure de gastro-entérite aiguë par ingestion de fruits de mer et les souches de V. cholerae non-O1/non-O139 peuvent provoquer des infections cutanées (Feldhusen, 2000). La bactérie V. alginolyticus est principalement associée à des infections à Vibrio d'origine non alimentaire telles des otites, des conjonctivites, des pyodermites superficielles (Sganga et al., 2009). Par ailleurs, le risque indirect de contraction des infections à Vibrio non cholériques lié à la consommation crue de certains aliments, notamment certains légumes existe puisque l’enquête ménage a montré que dans 45,8% des ménages, il y’a contact entre les crustacés et les autres aliments dans le panier de la ménagère. Le contact entre les crustacés et certains légumes dans le panier de la ménagère pourrait entrainer une contamination par Vibrio de ces légumes qui sont consommés crus et exposer ainsi de façon indirecte les personnes qui consommeront ces légumes crus au sein des ménages. Conclusion partielle La probabilité journalière de consommation des crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat est de 0,013. Cette probabilité est influencée par la prévalence de Vibrio dans les crabes et le taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage. Il ressort de cette étude que les ménagères consommatrices de crustacés sont conscientes du danger que représente la consommation de crustacés insuffisamment cuits et surtout achetés morts. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 127 V. Présence du bacille tuberculeux dans les crachats des patients et de parasites intestinaux dans les selles des patients et des élèves 1. Résultats 1.1. Prévalence de la paragonimose humaine et de la tuberculose pulmonaire au niveau des patients des deux centres antituberculeux Au total, 332 patients ont été inclus dans l’étude au niveau des deux centres antituberculeux (168 patients au CAT d’Adjamé et 164 patients au CAT de Treichville) pour maximiser nos chances de trouver des cas de paragonimose. Sur les 332 patients, 278 (83,7 %) ont fourni trois échantillons de crachats, un échantillon de selles et ont répondu à notre questionnaire. Ainsi sur les 278 patients, 36 (25,9 %) au niveau du CAT d’Adjamé et 26 (18,7%) au niveau du CAT de Treichville souffraient de la tuberculose pulmonaire. Aucun patient n’avait la paragonimose humaine (0 %) à l’analyse de leurs crachats (Tableau XXIV). Le risque relatif (RR) qui permet d’identifier les patients de la paragonimose parmi ceux qui consultent pour la tuberculose est donc nul. 1.2. Prévalence de la tuberculose pulmonaire au niveau des patients des deux centres antituberculeux en fonction de leur sexe Nous avons trouvé une différence significative de la tuberculose pulmonaire entre les 186 patients (86 au CAT d’Adjamé et 100 au CAT de Treicville) et les 146 patientes (82 au CAT d’Adjamé et 64 au CAT de Treichville) au niveau des deux CAT. En effet, le test de khi-deux a permis de montrer que les hommes étaient plus atteints par la tuberculose que les femmes (28,8 % contre 13,9 %, χ2 = 5,68, p = 0,02), P<0,05. Le tableau XXV donne la répartition des patients atteints par la tuberculose selon le sexe. 1.3. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux au niveau des patients des deux centres antituberculeux La recherche d’œufs de Paragonimus dans les selles des patients des centres antituberculeux s’est avérée négative mais des helminthes et des protozoaires intestinaux ont été retrouvés dans les selles des patients. Des cas de deux infestations (patients infestés par deux parasites à la fois) et trois infestations (patients infestés par trois parasites à la fois) ont été observés (Tableau XXVI). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 128 Tableau XXIV : Résultats de la recherche du bacille tuberculeux et de Paragonimus dans les crachats selon la répartition des patients dans les centres antituberculeux (n=278) Agents pathogènes Nombre de patients positifs (%) Nombre de patients négatifs (%) Total CAT d’Adjamé CAT de Treichville CAT d’Adjamé CAT de Treichville M. tuberculosis 36(25,9) 26 (18,7) 103 (74,1) 113(81,3) 278 Paragonimus sp. 0 (0) 0 (0) 139 (100) 139 (100) 278 Tableau XXV: Répartition des personnes atteintes par la tuberculose selon le sexe Sexe Effectif des patients examinés Effectif des patients infectés Pourcentage des patients infectés (%) [95 % IC] CAT d’Adjamé CAT de Treichville CAT d’Adjamé CAT de Treichville Hommes 72 84 28 17 28,8 [21,9-36,6] Femmes 67 55 8 9 13,9 [8,3-21,4] Total 139 139 36 26 22,3 [17,5-27,6] IC : intervalle de confiance THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 129 Tableau XXVI: Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux chez les patients des CAT (n = 278) Patients infestés au niveau des CAT, n=278 Parasites Effectifs des hommes (%) Effectifs des femmes (%) Effectifs Total (%) Aucune infestation 116 (74,3) 85 (69,6) 201 (72,3) Une infestation 35 (22,4) 25 (20,5) 60 (21,6) Helminthes 9 (5,7) 4 (3,3) 13 (4,6) Ankylostome 3 (1,9) 1 (0,8) 4 (1,4) Schistosoma mansoni 2 (1,3) 3 (2,4) 5 (1,8) Strongyloides stercoralis Paragonimus 4 (2,6) 0 0 0 4 (1,4) 0 Protozoaires Intestinaux 26 (16,7) 21 (17,2) 47 (16,9) Entamoeba coli 21 (13,4) 15 (12,3) 36 (12,9) Endolimax nana 3 (1,9) 2 (1,6) 5 (1,8) Giardia intestinalis 2 (1,3) 2 (1,6) 4 (1,4) Iodamoeba bütschlii 0 1 (0,8) 1 (0,3) Chilomastix mesnili 0 1 (0,8) 1 (0,3) Deux infestations 5 (3,2) 10 (8,2) 15 (5,4) Trois infestations 0 2 (1,6) 2 (0,7) THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 130 1.4. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux en fonction du sexe des patients Le test de khi-deux a permis de montrer que la différence d’infestation par les helminthes entre les hommes et les femmes n’était pas significative (5,7 % contre 3,3 %, χ2 = 0,87, p = 0,35), P > 0,05. Il a aussi permis de montrer que la différence d’infestation par les protozoaires intestinaux entre des hommes et les femmes n’était pas significative (16,6 % contre 17,2 %, χ2 = 0,01, p = 0,91), P > 0,05. Le tableau XXVII donne la répartition des patients infestés par les helminthes et les protozoaires selon le sexe. 1.5. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux au niveau des élèves des deux écoles primaires de Dabou Au total, pour maximiser nos chances de trouver des cas de paragonimose chez les élèves des deux écoles primaires de Dabou (145 élèves à N’Gatty et 124 élèves à Allaba), 269 élèves ont été inclus dans l’étude. Tous les 269 élèves enrôlés dans l’étude ont fourni un échantillon de selles pour la recherche d’œufs de Paragonimus par la technique de Kato-Katz et ont répondu à notre questionnaire. De ces 269 échantillons de selles, seulement 166 (61,7 %) ont été préservés dans une solution de SAF pour rechercher aussi des œufs de Paragonimus et d’autres parasites par la technique d’éther-concentration. Les 103 échantillons n’ayant pas pu être conservés dans la solution de SAF n’étaient pas suffisants pour faire à la fois la technique de Kato-Katz et les conserver dans du SAF pour effectuer ultérieurement la technique d’éther-concentration. La recherche d’œufs de Paragonimus dans les selles des élèves s’est avérée négative. Cependant des helminthes et des protozoaires intestinaux ont été retrouvés (Tableau XXVIII). 1.6. Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux en fonction du sexe des élèves des deux écoles primaires de Dabou Une différence significative de l’infestation par les helminthes entre les 152 garçons (85 à N’Gatty et 67 à Allaba) et les 117 filles (60 à N’Gatty et 57 à Allaba) a été trouvée au niveau des deux écoles primaires. En effet, le test de khi-deux a permis de montrer que les garçons étaient plus infestés par les helminthes que les filles (32,9 % contre 8,3 %, χ2 = 9,43, p = 0,002), P < 0,05. Il a aussi permis de montrer que la différence d’infestation par les protozoaires intestinaux entre les garçons et les filles n’était pas significative (57,4 % contre 13,9 %, χ2 = 2,28, p = 0,13), P > 0,05. Le tableau XXIX donne la répartition des élèves infestés par les helminthes et les protozoaires selon le sexe. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 131 Tableau XXVII:Répartition des patients infestés par les helminthes et les protozoaires selon le sexe IC: intervalle de confiance Effectif des patients examinés Effectif des patients infestés Pourcentage des patients infestés (%) [95 % IC] Helminthes Hommes 156 9 5,7 [2,7-10,7] Femmes 122 4 3,3 [0,9-8,2] Total 278 13 4,6 [2,5-7,8] Protozoaires Hommes 156 26 16,6 [11,2-23,5] Femmes 122 21 17,2 [10,9-25,1] Total 278 47 16,9 [12,7-21,8] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 132 Tableau XXVIII : Prévalence des helminthes et des protozoaires intestinaux chez les élèves (n = 166) Elèves infestés, n = 166 Parasites Effectifs des garçons (%) Effectifs des filles (%) Effectifs Total (%) Aucune infestation 54 (57,4) 54 (75,0) 108 (65,1) Une infestation 19 (20,2) 10 (13,9) 29 (17,5) Helminthes 31 (32,9) 6 (8,3) 37 (22,3) Ankylostome 19 (20,2) 3 (4.2) 22 (13,3) Trichocéphale 9 (9,6) 3 (4,2) 12 (7,2) Ascaris lumbricoides 3 (3,2) 0 3 (1,8) Paragonimus 0 0 0 Protozoaires Intestinaux 54 (57,4) 27 (37,5) 81 (48,8) Entamoeba coli 14 (14,9) 9 (12,5) 23 (13,8) Endolimax nana 13 (13,8) 5 (6,9) 18 (10,8) Blastocystis hominis 9 (9,6) 2 (2,8) 11 (6,6) Giardia intestinalis 3 (3,2) 5 (6,9) 8 (4,8) Entamoeba histolytica 6 (6,4) 5 (6,9) 11 (6,6) Iodamoeba bütschlii 5 (5,3) 1 (1,4) 6 (3,6) Chilomastix mesnili 4 (4,3) 0 4 (2,4) Deux infestations 10 (10,6) 4 (5,6) 14 (8,4) Trois infestations 4 (4,3) 2 (2,8) 6 (3,6) Quatre infestations 5 (5,3) 2 (2,8) 7 (4,2) Cinq infestations 2 (2,1) 0 2 (1,2) THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 133 Tableau XXIX: Répartition des élèves infestés par les helminthes et les protozoaires selon le sexe IC: intervalle de confiance Effectif des élèves examinés Effectif des élèves infestés Pourcentage des élèves infestés (%) [95 % IC] Helminthes Garçons 94 31 32,9 [23,6-43,4] Filles 72 6 8,3 [3,1-17,3] Total 166 37 22,3 [16,2-29,4] Protozoaires Garçons 94 54 57,4 [46,8-67,6] Filles 72 27 37,5 [26,4-49,7] Total 166 81 48,8 [40,9-56,6] THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 134 1.7. Symptômes de la paragonimose humaine, habitudes alimentaires et culinaires des patients et des élèves interrogés Le questionnaire fourni aux patients des CAT a permis de révéler que sur les 278 patients interrogés, 216 (77,7 %) consomment les crustacés. Il a aussi permis de révéler que la majorité d’entre eux consomment les crustacés sous la forme cuite. En effet, parmi les 216 consommateurs de crustacés, 204 (94,4 %) les consomment bouillis (en sauce), 10 (4,6 %) les mangent frits, 1 (0,5 %) sous la forme braisée et 1 (0,5 %) sous la forme crue. Par ailleurs, suite à la consommation de crustacés, 248 (89,2 %) patients parmi les 278 ont rapporté avoir eu la toux, 199 (71,6 %) parmi les 278 patients rapportaient des douleurs thoraciques et 52 (18,7 %) avaient rapporté une hémoptysie (Tableau XXX). Sur les 166 élèves interrogés, 163 (98,2 %) consomment les crustacés sous la forme bouillie (100 %). Les symptômes de maladies apparus suite à la consommation des crustacés, rapportés par la majorité des élèves sont la toux et des douleurs thoraciques. En effet, 87 (52,4 %) élèves parmi les 166 avaient la toux, 62 (37,3 %) élèves rapportaient des douleurs thoraciques et 17 (10,2 %) avaient une hémoptysie (Tableau 30). La plupart des patients (74,8%) et des élèves boivent l’eau de robinet (57,8). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 135 Tableau XXX: Caractéristiques de deux cohortes, facteurs potentiels de risque de la paragonimose et symptômes de cette parasitose * Elèves rapportant avoir eu la toux après consommation des crustacés ** Elèves rapportant avoir du sang dans les crachats Le diagramme ci-après décrit mieux la participation des élèves des deux écoles primaires de Dabou et des patients de deux centres antituberculeux d’Abidjan dans la recherche de la paragonimose humaine (Figure 37). Caractéristiques Patients des CAT, n = 278 Effectifs (%) Élèves, n = 166 Effectifs (%) Sexe Homme Femme 156 (56,1) 122 (43,9) 94 (56,6) 72 (43,4) Age (années) Moyenne Intervalle 37,7 [8 – 80] 11,23 [6 -15] Consommation de crustacés Non 62 (22, 3) 3 (1,8) Oui 216 (77,7) 163 (98,2) Bouillie (en sauce) 204 (94,4) 163 (100) Frite 10 (4,6) 0 Braisée 1 (0,5) 0 Crue 1 (0,5) 0 Source d’approvisionnement en eau Eau de robinet 208 (74,8) 96 (57,8) Eau de borne fontaine 6 (2,2) 0 Eau vendue dans la rue 57 (20,5) 1 (0,6) Puits 6 (2,2) 69 (41,6) Autre (marigot, rivière) 1 (0,4) 0 Symptômes de la paragonimose Toux chronique 248 (89,2) 87 (52,4) * Douleurs abdominales 199 (71,6) 62 (37,3) Hémoptysie 52 (18,7) 17 (10,2)** THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 136 A B 332 patients avec une toux chronique dans deux centres antituberculeux d’Abidjan ayant donné leur consentement écrit (Adjamé, n =168; Treichville, n = 164) 332 patients ayant répondu au questionnaire ▪ 46 n’ayant pas apporté leurs selles ▪ 8 n’ayant pas fourni trois crachats 278 patients (83,7%) ayant fourni toutes les données ▪ Répondu au questionnaire ▪ 3 échantillons de crachats fournis ▪ 1 échantillon de selles fourni ▪ 103 dont les selles n’ont pas pu être préservées dans du SAF pour la méthode d’éther- concentration 269 enfants enrôlés dans deux écoles primaires de Dabou ayant donné leur consentement écrit (Allaba, n =124 ; N’Gatty, n = 145) 269 élèves ayant répondu au questionnaire 166 élèves (61,7%) ayant fourni toutes les données ▪ Répondu au questionnaire ▪ Examen des selles par la technique de Kato-Katz ▪ Examen des selles par la technique d’éther-concentration Figure 37: Diagramme décrivant la participation à deux enquêtes épidémiologiques sur la paragonimose des patients de deux centres antituberculeux d’Abidjan (A) et des élèves de deux écoles primaires de Dabou (B) en 2009 et 2010. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 137 2. Discussion Dans la présente étude réalisée dans les centres antituberculeux de Treichville et d’Adjamé à Abidjan, et dans les écoles primaires d’Allaba et de N’Gatty de Dabou, aucune infestation à Paragonimus n’a été détectée bien que des symptômes spécifiques de la paragonimose aient été observés chez les patients et les élèves. Les symptômes caractéristiques d’une localisation pulmonaire du parasite sont la toux chronique, l’hémoptysie, des douleurs thoraciques et des lésions pulmonaires visibles sur radiographie pulmonaire (Moyou-Somo et al., 2003 b). En effet, 89,2 % des patients parmi les 278 ont rapporté avoir la toux, 71,6 % ont rapporté des douleurs thoraciques et 18,7 % une hémoptysie. Aussi, sur les 166 élèves interrogés, 52,4 % avaient-ils la toux, 37,3 % des douleurs thoraciques et 10,2 % une hémoptysie. Par ailleurs, une prévalence de 22,3 % de la tuberculose pulmonaire a été observée parmi les patients dans les centres antituberculeux de Treichville et d’Adjamé avec une prévalence significativement plus élevée chez les hommes que chez les femmes. De plus, des helminthoses autres que la paragonimose humaine, ainsi que des infections intestinales ont été observées aussi bien chez les patients que chez les écoliers. L’état de santé des patients dans les centres antituberculeux qui n’ont pas la tuberculose pulmonaire et la paragonimose humaine (77,7 %) incite à des études plus approfondies pour élucider l'étiologie de leur toux chronique qui nécessite un diagnostic approprié. L'absence de la paragonimose humaine chez les patients et les élèves pourrait s'expliquer par les pratiques culinaires notamment l'ébullition des crustacés qui détruit les métacercaires de Paragonimus. Les patients et les élèves affirment bien faire cuire les crustacés sous la forme bouillie dans des sauces avant de les consommer. En effet, les métacercaires hébergées par les crabes sont détruites après une cuisson des crustacés pendant au moins 10 min à une température de 55 ° C (Guillermain, 1981). Des recherches antérieures ont montré que les infestations à Paragonimus ont été détectées après l'analyse répétée d'échantillons d'expectorations et de selles prélevés à des intervalles de temps réguliers chez le même individu. Des cas de paragonimose humaine pourraient avoir été manqués, en raison du caractère irrégulier des œufs pondus par les parasites adultes, comme l’a montré Miyazaki (Miyazaki, 1991). Nous avons examiné trois échantillons d'expectorations sur deux jours au lieu d’un de tous les patients dans les centres de la tuberculose pour augmenter nos chances de trouver des œufs de Paragonimus (Moyou-Somo et al., 1983 ; Mukae et al., 2001). THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 138 Cependant aucun des échantillons de crachats n’a été trouvé positif pour les œufs de Paragonimus. En ce qui concerne les examens de selles, nous avons utilisé deux approches diagnostiques dans l'enquête épidémiologique sur la paragonimose humaine au niveau des deux écoles primaires de Dabou : la méthode de Kato-Katz et une méthode d’éther concentration appliquée à des échantillons de selles conservés dans une solution de SAF. La combinaison de ces deux techniques permet d’améliorer la précision du diagnostic des helminthoses (Steinmann et al., 2008 ; Knopp et al., 2008). Pourtant, dans la présente étude, aucun œuf de Paragonimus n’a été trouvé. Un certain nombre d'études à grande échelle a été mené dans différentes régions de la Côte d'Ivoire, à la fois dans les écoles et dans des communautés entières sur les parasites intestinaux et la bilharziose. Ces études ont permis de trouver des prévalences d’helminthes et de protozoaires intestinaux plus élevées que celles obtenues dans notre étude (Utzinger et al., 2010 ; Utzinger et al., 1999 ; Keiser et al., 2002 ; Staubli et al., 2001; N’Goran et al., 2003 ; Raso et al., 2004; Ouattara et al., 2010 ; Glinz et al., 2010). Bien que nous n’ayons pas pu identifier des cas de paragonimose humaine dans l'étude actuelle, nous ne pouvons pas conclure que la paragonimose humaine est totalement absente de la Côte d'Ivoire. La paragonimose humaine, semblable à d'autres trématodoses, a une distribution très focale. Typiquement, les foyers de transmission sont détectés avec le diagnostic d'une personne gravement malade qui va se faire soigner dans un service de santé (Strobel et al., 2005). Le dépistage de cette personne peut conduire à une enquête approfondie pour la caractérisation du foyer (Odermatt et al., 2007 a). Une surveillance à grande échelle est donc nécessaire afin de détecter activement les foyers de paragonimose humaine. Une approche par questionnaire s'est avérée utile pour le dépistage de la paragonimose humaine en Asie du Sud-est (Odermatt et al., 2009). Cette approche pourrait également améliorer le taux de détection des cas de tuberculose pulmonaire (Odermatt et al., 2007 b). Il serait intéressant de valider cette approche par questionnaire dans un contexte africain. Des études récentes ont montré que les œufs de Paragonimus ne sont pas détruits par la technique de coloration de Ziehl-Neelsen largement utilisée pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire (Slesak et al., 2011). Par conséquent, les cas de paragonimose humaine peuvent être détectés rétrospectivement par le réexamen des échantillons d’expectorations colorés par la technique de Ziehl-Neelsen et conservés dans les centres de la tuberculose. THESE DE DOCTORAT Troisième partie : résultats et discussion TRAORE Sylvain Gnamien 139 Conclusion partielle Aucun cas de paragonimose humaine n’a été détecté dans la présente étude réalisée dans les centres antituberculeux de Treichville et d’Adjamé à Abidjan et dans les écoles primaires d’Allaba et de N’Gatty de Dabou. Cependant, une prévalence de 22,3 % de la tuberculose pulmonaire a été observée parmi les patients dans ces deux centres antituberculeux et des helminthoses autres que la paragonimose humaine, ainsi que des protozooses intestinales ont été observées aussi bien chez les patients que chez les écoliers. Bien que nous n’ayons pas pu dépister des cas de paragonimose humaine dans notre étude, une attention particulière doit être accordée à certaines personnes qui consomment les crustacés sous la forme crue ou braisée et certaines populations cibles (enfants, ménagères, pêcheurs) qui manipulent ou consomment les crustacés lorsqu’elles sollicitent les services de santé pour une toux chronique. . MEMOIRE DE THESE UNIQUE Conclusion générale TRAORE Sylvain Gnamien 140 CONCLUSION GENERALE THESE DE DOCTORAT Conclusion générale TRAORE Sylvain Gnamien 141 Ce travail qui s’intègre dans l’évaluation du risque de contraction des infections à Vibrio et des infestations à Paragonimus suite à la consommation des crabes et des crevettes vendus sur les marchés d’Abidjan et de Dabou avait plusieurs objectifs spécifiques. Il a permis de montrer que les crabes Callinectes et les crevettes Penaeus étaient contaminés par les Vibrio (7,8 %) et qu’aucun crabe appartenant à l’espèce Cardisoma armatum ni aucune crevette Macrobrachium n’étaient contaminés par les Vibrio. L’identification des 25 souches de Vibrio isolées des crustacés a révélé qu'elles appartenaient à trois espèces qui sont V. cholerae non O1 et non O139 (24%), V. parahaemolyticus (36%) et V. alginolyticus (40%) dont cette dernière était l’espèce prédominante. Les gènes codant pour des facteurs de virulence majeurs de Vibrio cholerae et de Vibrio parahaemolyticus n'ont pas été détectés par PCR. Les discussions de groupes entreprises pour l’évaluation du risque d’infection à Vibrio lié à la consommation des crustacés ont permis de montrer que les ménagères consommatrices des crustacés sont conscientes que la consommation de crustacés insuffisamment cuits et achetés morts peut entrainer des maux de ventre et des diarrhées. Ainsi pour éviter de contracter des infections liées à la consommation des crustacés, elles font bien cuire les crustacés avant de les consommer. Une évaluation de l’exposition des consommateurs de crustacés au danger Vibrio a donc été réalisée grâce à une modélisation stochastique qui a permis de trouver une probabilité journalière de consommation des crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat de 0,013. Cette probabilité journalière de consommation de crustacés contaminés par Vibrio au moment de leur achat est influencée par la prévalence de Vibrio dans les crabes et le taux journalier moyen de consommation des crustacés par ménage qui est lui-même lié à la fréquence journalière de consommation des crustacés. La recherche de métacercaires de Paragonimus dans les crustacés a montré que les crabes Callinectes et Cardisoma armatum n’étaient pas infestés par Paragonimus mais contenaient des métacercaires d’autres trématodes (11,8 %). Les crabes Callinectes et Cardisoma armatum sont donc des hôtes intermédaires de trématodes autres que Paragonimus. Par ailleurs, les analyses de selles et de crachats effectuées auprès des élèves de Dabou et des patients des CAT d’Adjamé et de Treichville n’ont pas permis de trouver des cas de paragonimose. Cependant, une prévalence de 22,3 % de la tuberculose pulmonaire a été trouvée au niveau des centres antituberculeux avec une infection significativement plus THESE DE DOCTORAT Conclusion générale TRAORE Sylvain Gnamien 142 élevée chez les hommes que chez les femmes (28,8 % contre 13,9 %). En outre, au niveau des écoles primaires, les garçons étaient significativement plus infestés par les helminthes que les filles (32,9 % contre 8,3 %). Les facteurs de risques de la paragonimose n’ont pas pu être déterminés parce que d’une part Paragonimus n’a pas été retrouvé dans les crustacés analysés, et d’autre part aucun cas de paragonimose n’a été détecté aussi bien chez les patients des centres antituberculeux que chez les élèves des deux écoles primaires. Cependant, de potentiels facteurs de risques d’infections à Vibrio liés à la consommation des crustacés ont été déterminés. Ces facteurs sont: les conditions de vente, le contact des crustacés avec les autres aliments dans le panier de certaines ménagères, la consommation journalière des crustacés par certains ménages, la courte durée de cuisson des crustacés et la consommation de la moitié d’un crabe plat par personne au sein de certains ménages. En effet, l’enquête auprès des vendeuses de crustacés a révélé que la plupart d’entre elles (70,2 %), vendaient les crustacés sans glace. L’enquête ménage a révélé que 11,7 % des ménages consommaient les crustacés tous les jours et que le temps de cuisson des crustacés dans les ménages variait de 5 minutes à plus d’une heure. Les crabes du genre Callinectes (crabes plats) sont plus consommés dans 89,2 % des ménages, avec 82,5 % de ménages les achetant vivants et 6,7 % les achetant morts. L’enquête ménage a également montré que dans 43,3 % des ménages, chacune des personnes habitant dans ces ménages consomme la moitié d’un crabe plat et qu’il y avait un contact direct entre les crustacés et les autres aliments dans le panier de la ménagère dans 45,8 % des ménages. THESE DE DOCTORAT Recommandations TRAORE Sylvain Gnamien 143 RECOMMANDATIONS THESE DE DOCTORAT Recommandations TRAORE Sylvain Gnamien 144 L’étude a permis de montrer qu’il existe de potentiels facteurs de risque d’infections liés à la consommation des crustacés. Eu égard à ces potentiels facteurs de risque que peut constituer la consommation de crustacés crus ou insuffisamment cuits, il nous apparaît important de faire à l’endroit des autorités, des vendeuses et des consommateurs de ces aliments, quelques recommandations Les autorités doivent sensibiliser les commerçantes aux bonnes pratiques d’hygiène afin de réduire la multiplication des Vibrio en particulier et celle des autres bactéries dans les crustacés. Les commerçantes doivent vendre les crustacés dans des récipients propres et désinfectés à chaque vente. Les vendeuses de crevettes doivent veiller à ce que les crevettes soient vendues toute la journée avec de la glace pour maintenir leur température de vente. Les consommateurs de crustacés doivent faire correctement cuire les crabes et les crevettes avant de les consommer et surtout les consommer juste après leurs cuissons pour éviter une multiplication éventuelle des vibrions. Il faudra qu’ils évitent de mélanger les crustacés avec les autres aliments dans le panier de la ménagère ou de les conserver au réfrigérateur au contact des autres aliments à cause de la contamination croisée entre crustacés contaminés par Vibrio sp. et par d’autres germes et les autres aliments. Il faudra également qu’ils évitent d’acheter les crabes morts. Même si l’étude n’a pas permis de trouver des cas de paragonimose au niveau des centres antituberculeux, le diagnostic différentiel entre la paragonimose humaine et la tuberculose pulmonaire doit être systématiquement effectué chez tous les tousseurs chroniques en examinant leur crachat pour détecter d’éventuel cas de paragonimose. La recherche des deux germes (Paragonimus et Bacille tuberculeux) peut se faire sur le même crachat et la recherche de Paragonimus dans les crachats nécessite peu de moyens. THESE DE DOCTORAT Perspectives TRAORE Sylvain Gnamien 145 PERSPECTIVES THESE DE DOCTORAT Perspectives TRAORE Sylvain Gnamien 146 Les résultats obtenus et les commentaires dégagés dans ce présent travail sont bien loin d’apporter de façon exhaustive toutes les réponses quant à la qualité sanitaire des crustacés et le risque de contraction des infections à Vibrio et des infestations à Paragoninus. Il nous paraît alors important, pour la poursuite de ce travail, de déterminer la dose de Vibrio effectivement ingérée par les consommateurs de crustacés par la recherche de Vibrio dans les crustacés cuits afin d’établir d’une part la relation entre la dose de Vibrio ingérée et la survenue d’une infection à Vibrio et le risque annuel d’infection à Vibrio lié à de multiples expositions. Il serait utile aussi d’identifier par la biologie moléculaire les métacercaires de trématodes que nous avons retrouvées dans les crabes. Cette identification permettra de connaître les espèces de trématodes qui infestent les crabes Cardisoma et Callinectes. Il serait aussi utile de réaliser la même étude au niveau d’autres sites de production notamment la ville de Grand-Lahou et celle de Jacqueville. Par ailleurs, il serait important de rechercher des cas de paragonimose humaine rétrospectivement par le réexamen des échantillons d’expectorations colorés par la technique de Ziehl-Neelsen et maintenus dans les centres antituberculeux. En effet, des études récentes ont montré que les œufs de Paragonimus ne sont pas détruits par la technique de coloration de Ziehl-Neelsen largement utilisée pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire. Il importe aussi que d’autres études soient entreprises sur le plan chimique afin de mieux cerner le risque sanitaire lié à la consommation des crabes et des crevettes vendus sur les marchés en Côte d’Ivoire. Au plan chimique, il serait nécessaire de contrôler par exemple les taux d’histamine, de pesticides et de perturbateurs endocriniens tels que le PCB (PolyChoroBiphényl) dans les crustacés. Les poissons vendus sur les marchés en Côte d’Ivoire pourraient constituer une bonne matrice pour la recherche de polluants chimiques, de trématodes et de nématodes d’intérêt pour la santé publique mais aussi pour la recherche de bactéries potentiellement pathogènes pour l’homme. THESE DE DOCTORAT Références bibliographiques TRAORE Sylvain Gnamien 147 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES THESE DE DOCTORAT Références bibliographiques TRAORE Sylvain Gnamien 148 Acuna M.T., Diaz G., Bolanos H., Barquero C., Sanchez O., Sanchez L.M., Mora G., Chaves A., Campos E., 1999. Sources of Vibrio mimicus contamination of turtle eggs. Appl Environ Microbiol. 65: 336–338. Adingra AA., Guiral D., Arfi R., 1997. 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