植物遗传资源学报 2017，18( 3) : 530-537
Journal of Plant Genetic Ｒesources DOI: 10． 13430 / j． cnki． jpgr． 2017． 03． 018
基于 PAL 基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析
李 敏1，2，张宗文2，3，李艳琴1，吴 斌2，高 佳2
( 1山西大学生物技术研究所，太原 030006; 2 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081;
3国际生物多样性中心东亚办事处，北京 100081)
摘要: 苦荞在中国具有广泛的栽培种植地区，长时间演化形成了丰富的遗传多样性。为了研究和利用苦荞资源，以国内
北方苦荞产区( 内蒙古、青海、陕西、山西、甘肃) 、西南苦荞产区( 西藏、四川、贵州、云南) 、国内其他地方品种( 江西、安徽、湖
北、湖南、广西) 及国外品种( 尼泊尔) 共计 67 份苦荞材料为研究对象，PCＲ 扩增其 PAL 基因并测序。在此基础上分析苦荞的
遗传多样性，并采用 NJ 法( neighbor-joining) 对 67 份苦荞材料构建系统进化树。结果表明，供试的 67 份苦荞材料的 PAL 基因
序列长度为 2011 bp，其中，变异位点为 160 个，占序列总长度的 7． 9%，简约信息位点为 33 个，占序列总长度的 1． 64%，突变
的类型主要是碱基的转换与颠换，高变异位点均集中在外显子 2 的 N 端。不同来源的苦荞材料间的遗传距离分布于 0． 002 ～
0． 016 之间，来源于中国四川组的苦荞材料种内平均遗传距离最大( 0． 016) ，中国内蒙古组的最小( 0． 002) 。中国四川地区的
材料与其他地区来源的材料间的遗传距离位于 0． 010 ～ 0． 016 之间，而其他地区间的遗传距离为 0． 004 ～ 0． 013。67 份苦荞材
料的平均 π 值和 θ 值分别为 0． 0034 和 0． 0143。其中，中国四川材料的 π 值为 0． 0148。基于 PAL 基因序列构建的 NJ 进化树
中，67 份苦荞材料分为 7 个类群，分类与地理来源无关。仅中国西藏来源的 5 份材料聚集为一类，说明 PAL 基因序列较为稳
定，多数材料间变化差异较小。中国四川地区的苦荞材料具有丰富的遗传多样性，中国西藏地区的某一材料中有较多的 SNP
位点，推测中国西藏的部分材料可能存在突变的热点区，预示着 PAL 基因新的突变位点区域。
关键词: 苦荞; PAL 序列; 遗传多样性
Genetic Diversity of Tartary Buckwheat Based on the
Sequence Analysis of PAL
LI Min1，2，ZHANG Zong-wen2，3，LI Yan-qin1，WU Bin2，GAO Jia2
( 1 Institute of Biotechnology of Shanxi University，Taiyuan 030006;
2 Insititute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081;
3The Office for East Asia，Biodiversity International，Beijing 100081)
Abstract: Tartary buckwheat is widely cultivated in different areas of China and gradually evolved into genetic
diversity． In order to study and utilize the tartary buckwheat，the PAL gene differences of the tartary buckwheat were
analyzed on 67 samples，which were collected from different provinces of China( including the north region and the
southwest region) and the Nepal region． We amplified the PAL gene by PCＲ and then acquired the sequence results．
Based on the sequences，genetic diversity was analyzed and cluster of analysis of 67 samples was also carried out by
NJ method． The results showed that after aligning and splicing，the length the PAL sequence was 2011 bp in the ma-
trix，the variable sites was 160，while the parsimony informative sites was 33，accounting for 7． 9% and 1. 64% of
the total length，respectively． Variable type were mainly base transition and base transversions． Variable site mainly
concentrated in the region of 600-1200，which was the site of the N-terminal of the exon-2． The intra-specific mean
收稿日期: 2016-12-29 修回日期: 2017-02-10 网络出版日期: 2017-04-21
UＲL: http: / /kns． cnki． net /kcms /detail /11． 4996． S． 20170421． 0931． 010． html
基金项目: 科技部科技支撑计划项目( 2013BAD01B05-2) ; 农业部国家作物种质资源保护专项( 2015NWB030-06)
第一作者主要从事荞麦种质资源遗传多样性研究。E-mail: limin910326@ 163． com
通信作者: 张宗文，主要从事荞麦种质遗传多样性研究。E-mail: zhangzongwen@ caas． cn
李艳琴，主要从事植物功能成分研究。E-mail: yanqin@ sxu． edu． cn
3 期 李 敏等: 基于 PAL 基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析 531
distance of the Sichuan group was 0． 016，while the tartary buckwheat from Inner Mongolia group showed that the in-
tra-specific mean distance was 0． 002． And it revealed that there was a significant difference among the tartary buck-
wheat resources in genetics diversity from different geographic origins． We checked the 67 PAL sequences using soft-
ware． And it showed that the average value of the Nucleotide polymorphism( π) and the average heterozygosity( θ)
were 0． 0034 and 0． 0143，respectively． The Nucleotide polymorphism ( π) value in samples from Sichuan was the
highest( 0． 0148) ． From the phylogenetic tree，it indicated that the 67 samples from the different province could be
clustered into seven categories． And the 5 sample in Tibet were clustered into another category． These results showed
that the PAL sequences of the majority tartary buckwheat samples was stable and the differences between the most
samples was not significant． The samples in Sichuan province had abundant genetic diversity． But only in samples
from Tibet it revealed many SNPs site，and this should be the new mutation spots in the PAL coding regions．
Key words: tartary buckwheat; PAL sequence; genetic diversity
苦荞( Fagopyrum tataricum( L． ) Gaertn． ) ，属于蓼 组成［8］，但有关 PAL 基因遗传多样性的研究未见报道。
科荞麦属，也称鞑靼荞麦，是药食兼用的一年生作 生物中的 DNA 序列模式能够为物种的进化与
物［1］。苦荞有较高的营养价值和药用价值，不仅含有人 发展提供非常有用的信息，通过了解自然选择影响
体所需的多种营养成分，如: 蛋白质、淀粉、脂肪、粗纤维、 下的单个基因的分子变异情况可以为物种的遗传进
维生素和矿物元素，而且含有较多的芦丁、苦味素等功能 化和由 分 子 变 异 导 致 的 性 状 改 变 提 供 有 效 的 解
性成分，具有防治糖尿病［2］、抗氧化［3-4］、降血脂［5-6］、降血 释［9］。因此，本试验以 67 份苦荞为材料，通过 PCＲ
糖、安神、消炎等多种功能作用。因此，苦荞被称为 21 世 产物直接测序的方法获得 PAL 基因编码区序列，分
纪具有前途的绿色食品。苦荞起源于中国，苦荞遗传资 析苦荞 PAL 基因序列的差异和变异程度，进而探讨
源丰富，其生产地主要集中在我国西南地区的云南、四 苦荞种质的遗传多样性，以及基于 PAL 基因的苦荞
川、贵州等省市的高海拔地区、高原和高寒地区，黄土高 种质的进化关系，为挖掘相关分子标记，开展分子辅
原的山西、陕西、内蒙古、甘肃等省区也有种植和分布。 助选择研究奠定基础。
苯丙氨酸解氨酶( PAL) 是苦荞的黄酮类化合物合 1 材料与方法
成途径中的第 1 个酶，也是第 1 个关键酶［7］。该酶催
化苯丙氨酸脱氨基转化为肉桂酸，位于整个次生代谢 1． 1 材料
途径的中心地位，并控制整个代谢途径的起始。苯丙 试验材料为苦荞地方品种，共 67 份，包括来自
氨酸解氨酶基因( PAL) 是编码苯丙氨酸解氨酶的结构 国内四川、云南、贵州、西藏、青海等省自治区的 66
基因。目前，已经成功获得苦荞 PAL 基因的 cDNA 序 份材料以及国外尼泊尔的 1 份材料，材料的代号、统
列，并通过 DNA 与 cDNA 的序列比对明确其基因结构 一编号、名称、来源如表 1 所示。
表 1 供试的苦荞材料名称、来源
Table 1 The code and origins of the tested Fagopyrum tataricum( L． ) Gaertn．
代号 统一编号 品种名称 来源 代号 统一编号 品种名称 来源
Code Accessions number Name Origin Code Accessions number Name Origin
1 QM000967 苦荞 中国内蒙古 IM 11 QM000988 苦荞 中国西藏 XZ
2 QM000969 苦荞 中国内蒙古 IM 12 QM002367 苦荞 中国西藏 XZ
3 QM000972 苦荞麦 中国青海 QH 13 QM002393 苦荞 中国西藏 XZ
4 QM001215 苦荞 中国青海 QH 14 QM002394 苦荞 中国西藏 XZ
5 QM001218 苦荞 中国青海 QH 15 QM000997 荞麦 中国山西 SX
6 QM001219 苦荞 中国青海 QH 16 QM001007 苦荞 中国山西 SX
7 QM000976 黑粒苦荞 中国西藏 XZ 17 QM001024 苦荞 中国山西 SX
8 QM000979 苦荞 中国西藏 XZ 18 QM001038 苦荞 中国山西 SX
9 QM000981 苦荞 中国西藏 XZ 19 QM002447 岭东苦荞 中国山西 SX
10 QM000985 苦荞 中国西藏 XZ 20 QM002464 灵丘苦荞 中国山西 SX
532 植 物 遗 传 资 源 学 报 18 卷
表 1( 续)
代号 统一编号 品种名称 来源 代号 统一编号 品种名称 来源
Code Accessions number Name Origin Code Accessions number Name Origin
21 QM002470 灵丘苦荞 中国山西 SX 45 QM002666 水城苦荞 中国贵州 GZ
22 QM001078 米米苦荞 中国陕西 SHX 46 QM002680 威黑Ⅱ-3 中国贵州 GZ
23 QM001094 苦荞 中国陕西 SHX 47 QM002686 麻子荞 中国贵州 GZ
24 QM001142 苦荞麦 中国甘肃 GS 48 QM001390 刺荞 中国云南 YN
25 QM001154 黑绿荞 中国甘肃 GS 49 QM001394 贡山苦荞 中国云南 YN
26 QM001161 苦荞 中国甘肃 GS 50 QM001400 中甸苦荞 中国云南 YN
27 QM001170 小荞麦 中国甘肃 GS 51 QM001404 营盘苦荞 中国云南 YN
28 QM001187 小荞 中国甘肃 GS 52 QM001426 长咀苦荞 中国云南 YN
29 QM001194 麻苦荞 中国甘肃 GS 53 QM001463 大苦荞 中国云南 YN
30 QM002515 金荞 中国甘肃 GS 54 QM001479 细苦荞 中国云南 YN
31 QM002527 麻苦荞 中国甘肃 GS 55 QM001487 白云苦荞 中国云南 YN
32 QM002538 甘荞 1 号 中国甘肃 GS 56 QM002690 格那务起 中国云南 YN
33 QM001234 额洛乌起 中国四川 SC 57 QM002400 87-23( F6080) 尼泊尔 Nepal
34 QM001320 额乌 中国四川 SC 58 QM002571 苦荞麦 中国安徽 AH
35 QM002624 黑苦荞 中国四川 SC 59 QM002574 苦荞 中国湖北 HB
36 QM002629 初额 中国四川 SC 60 QM002594 苦荞 中国湖北 HB
37 QM002631 额洛木尔惹 中国四川 SC 61 QM002600 苦荞 中国湖北 HB
38 QM002849 苦荞 中国四川 SC 62 QM002601 苦荞 中国湖北 HB
39 QM001348 彭泽苦荞 中国江西 JX 63 QM002606 苦荞 中国湖北 HB
40 QM001349 九江苦荞 中国江西 JX 64 QM002609 新邵苦荞 中国湖南 HN
41 QM001361 长尖咀苦荞 中国贵州 GZ 65 QM002610 塘弯苦荞 中国湖南 HN
42 QM001363 黑苦荞 中国贵州 GZ 66 QM002611 洗马苦荞 中国湖南 HN
43 QM001377 苦荞 中国贵州 GZ 67 QM002707 苦荞 中国广西 GX
44 QM002661 苦荞 中国贵州 GZ
IM: Inner Mongolia，QH: Qinghai，XZ: Xizang，SX: Shanxi，SHX: Shannxi，GS: Gansu，SC: Sichuan，GZ: Guizhou，JX: Jiangxi，YN: Yunnan，AH: Anhui，
HB: Hubei，HN: Hunan，QX: Guangxi，the same as below
1． 2 方法 1． 2． 2 PCＲ 扩增、测序 PAL 序列扩增所用引物
1． 2． 1 DNA 的提取与检测 取供试材料种子萌发 基于 NCBI 上公布的苦荞 PAL 的基因序列( 登录号
至 3 ～ 4 片叶龄时的幼嫩叶片，采用 QIAGEN 公司提 为 GQ285125) ，由 oligo 7． 0 设计，能够获得 PAL 基
供的 DNeasy Plant Mini Kit( 50) 提取基因组 DNA，用 因扩增产物的 3 对引物序列如表 2。所用引物均由
1%琼脂糖凝胶电泳技术及超微量分光光度计检测 上海生工生物工程股份有限公司合成后，纯水溶解、
DNA 的纯度和浓度，稀释至其工作浓度 30 ng /mL。 稀释，浓度为 10 μmol /L。
表 2 所用引物名称及其序列
Table 2 The name and the sequence of the primer used
引物 引物序列( 5'-3') 引物长度( bp) PCＲ 片段大小( bp)
Primer Primer sequence( 5'-3') Primer length Amplified length
Forward Primer1 TAAGGCCAGCAGTGATTGGGTTAT 24 2393
Ｒeverse Primer1 GTACAGTGGGTATGATCTGCATTC 24
Forward Primer2 ATGGGGGTCTCAAACGGA 18 2549
Ｒeverse Primer2 CTCCAGTGAGGGCAGTGAA 19
Forward Primer3 TAAGGAAGGCGGTGCTCTT 19 2166
Ｒeverse Primer3 CTCCAGTGAGGGCAGTGAA 19
3 期 李 敏等: 基于 PAL 基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析 533
PCＲ 反应体系为 20 μL，包括 10 × buffer 2 μL， 获得总长为 2011 bp 的 PAL 基因序列矩阵。苦荞
2． 5 mM dNTP 0． 4 μL，10 μM 引 物 各 0． 6 μL， PAL 基因序列包含 2 个外显子及 1 个内含子。其中
2． 5 U /μL Taq DNA 聚合酶 0． 4 μL，DNA 模板1 μL， 外显子 1 的长度为 419 bp，外显子 2 的长度为 1747
ddH2O 15 μL。PCＲ 扩增程序 如 下: 95 ℃ 预 变 性 bp，内含子的长度为 451 bp，总长为 2617 bp。将扩
5 min，以下程序循环 35 次: 94 ℃变性 30 s，54 ℃退 增 的 PAL 基 因 序 列 与 GenBank ( 登 录 号 为
火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min。循环结束后，72 ℃ 延伸 GQ285125) 上已知的 Ftpal 序列进行比对，本研究获
5 min，4 ℃保存。PCＲ 扩增在 Biorad 公司的 mycy- 得的 PAL 序列覆盖了 PAL 基因全长的 76%，包含了
cler 型 PCＲ 仪上进行。扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶 内含子的全部序列和外显子 2 的大部分序列。
电泳检测合格后，由北京天一辉远生物科技有限公 采用 MEGA 6． 0 及 DnaSP 5． 0 软件对 67 份苦
司进行测序。 荞材料的 PAL 基因序列进行分析，得到相关的遗传
1． 2． 3 序列编辑及系统发育分析 用 DNAMAN 进 多样性参数( 表 3) 。在总长 2011 bp 的 PAL 序列矩
行序列编辑拼接，空 位 作 缺 失 处 理。采 用 MEGA 阵中，变异位点为 160 个，占序列总长度的 7． 9%，
6. 0 软件包进行序列校对并对序列长度、多态性位 简约信息位点为 33 个，占序列总长度的 1． 64%。π
点数、简约信息位点等序列特征进行分析。利用 值是衡量不同的序列在同一位点存在的核苷酸的平
ClustalX 1． 83 软件中的 Do Complete Alignment 功能 均差异，θ 值则是衡量群体内同源 DNA 序列上每个
对 67 份苦荞材料的 PAL 基因序列进行多序列比 位点的变异。从表 3 可以看出，67 份苦荞材料 PAL
对，进行单核苷酸变异分析。用 DnaSP 5． 0 软件计 基因的平均核苷酸多样性 π 值、平均杂合度 θ 值分
算核苷酸多样性 π 值、平均杂合度 θ 值［10］，研究苦 别为 0. 0034 和 0． 0143。此外，将材料按地区划分
荞 PAL 基因序列的多样性。采用 1000 次自展重复 为不同组，其中材料来源较少的与其毗邻的省份分
检测支持率，构建遗传距离矩阵。基于 Jukes-Cantor 为同组，尼泊尔与中国西藏一组，中国安徽与江西一
距离法构建邻接( neighbor-joining) 系统进化树［11］。 组，中国广西与云南一组。不同地区的苦荞材料
2 PAL 基因的核苷酸多样性 π 值的变化范围介于 0．
结果与分析 0019 ～ 0． 0148，平均杂合度 θ 值的变化范围介于 0．
2． 1 PAL 序列特征及遗传多样性参数分析 0019 ～ 0． 0153。从 π 值和 θ 值看，中国四川地区苦
采用设计的 3 对引物，对 67 份苦荞 PAL 基因进 荞材料的遗传多样性最为丰富，而中国江西 /安徽材
行扩增、回收和测序，经序列比对校正，两端切平后， 料的遗传多样性最低。
表 3 苦荞 PAL 基因的遗传多样性参数
Table 3 The genetic diversity index of the PAL sequence of the tartary buckwheat
来源 品种数 多态性位点 简约信息位点 核苷酸多样性 平均杂合度
Origin Sample size Varible sites Parsimony informative sites π θ
中国四川 SC 6 40 6 0． 0148 0． 0153
中国西藏 /尼泊尔 XZ /Nepal 9 38 4 0． 0140 0． 0141
中国贵州 GZ 7 23 3 0． 0106 0． 0124
中国云南 /中国广西 YN /GX 10 23 6 0． 0129 0． 0131
中国山西 SX 7 20 4 0． 0123 0． 0148
中国湖北 HB 5 14 1 0． 0064 0． 0076
中国湖南 HN 3 13 1 0． 0075 0． 0075
中国甘肃 GS 9 12 4 0． 0050 0． 0027
中国陕西 SHX 2 7 1 0． 0076 0． 0076
中国青海 QH 4 6 1 0． 0035 0． 0037
中国内蒙古 IM 2 4 1 0． 0038 0． 0038
中国江西 /中国安徽 JX /AH 3 4 1 0． 0019 0． 0019
总体 Total 67 160 33 0． 0034 0． 0143
534 植 物 遗 传 资 源 学 报 18 卷
PAL 序 列 的 核 苷 酸 多 态 性 位 点 分 布 情 况 见
图 1、图 2。由图 1、图 2 可以看出，π 值和 θ 值的变
化趋势相一致，但在不同区域的变化程度存在一定
的差异，即 PAL 基因的序列多样性在基因各区域中
的分布是不均匀的。但无论是 π 值还是 θ 值，高变
异位点均集中在约 600 ～ 1200 bp 之间，这一区域正
好是外显子 2 的 N 端。
图 2 PAL 基因序列内平均杂合度( θ) 的变化
Fig． 2 The variations of heterozygosity( θ) in PAL
2． 2 基于 PAL 序列的不同来源苦荞组内和组间遗
传距离分析
采用 MEGA 6． 0 软件，选择 Juke-Cantor 距离模
型，对苦荞 PAL 序列数据进行分析，将来源省份相
同的苦荞材料进行分组，得到不同来源苦荞组内的
图 1 PAL 基因序列内核苷酸多样性( π) 平均 遗 传 距 离 ( 表 4 ) 和 组 间 的 平 均 遗 传 距
Fig． 1 The variations of nucleotide diversity( π) in PAL 离( 表 5) 。
表 4 基于 PAL 序列计算的苦荞组内的平均遗传距离
Table 4 Genetic distances within the Fagopyrum tataricum( L． ) Gaertn． group based on PAL sequences
中国 中国 中国西藏 / 中国 中国 中国 中国 中国江西 / 中国 中国云南 / 中国 中国
项目
内蒙古 青海 尼泊尔 山西 陕西 甘肃 四川 中国安徽 贵州 中国广西 湖北 湖南
Item
IM QH XZ /Nepal SX SHX GS SC JX /AH GZ YN /GX HB HN
平均遗传距离 0． 002 0． 004 0． 009 0． 008 0． 013 0． 008 0． 016 0． 005 0． 009 0． 011 0． 012 0． 014
Genetic distances
表 5 由 PAL 序列计算的苦荞组间的平均遗传距离
Table 5 Genetic distances between the Fagopyrum tataricum( L． ) Gaertn． groups based on PAL sequences
中国 中国 中国西藏 / 中国 中国 中国 中国 中国江西 / 中国 中国云南 / 中国
来源
内蒙古 青海 尼泊尔 山西 四川 甘肃 陕西 中国安徽 贵州 中国广西 湖北
Origin
IM QH XZ /Nepal SX SC GS SHX JX /AN GZ YN /GX HB
中国青海 QH 0． 004
中国西藏 /尼泊尔 XZ /Nepal 0． 007 0． 008
中国山西 SX 0． 007 0． 006 0． 009
中国四川 SC 0． 010 0． 011 0． 012 0． 011
中国甘肃 GS 0． 006 0． 007 0． 009 0． 008 0． 012
中国陕西 SHX 0． 008 0． 009 0． 012 0． 011 0． 014 0． 011
中国江西 /中国安徽 JX /AH 0． 005 0． 004 0． 007 0． 006 0． 010 0． 007 0． 010
中国贵州 GZ 0． 007 0． 008 0． 011 0． 010 0． 014 0． 010 0． 011 0． 009
中国云南 /中国广西 YN/GX 0． 008 0． 008 0． 011 0． 010 0． 012 0． 010 0． 012 0． 008 0． 011
中国湖北 HB 0． 009 0． 009 0． 011 0． 011 0． 012 0． 011 0． 013 0． 009 0． 013 0． 009
中国湖南 HN 0． 009 0． 010 0． 011 0． 011 0． 014 0． 011 0． 013 0． 010 0． 011 0． 009 0． 013
就遗传距离而言，无论是来源相同的苦荞品种 四川地区的苦荞材料种内平均遗传距离最大 ( 0．
间还是来源不同的苦荞品种间，基本处于同一水平。 016) ，中国内蒙古地区的苦荞材料种内平均遗传距
由表 4 中可以看出，在 PAL 基因序列中，苦荞同一 离最小( 0. 002) 。说明中国四川省内的苦荞材料的
组内的遗传差异随其来源的不同而异，来源于中国 遗传多样性最为丰富。而表 5 中显示不同来源的苦
3 期 李 敏等: 基于 PAL 基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析 535
荞材料的组间平均遗传距离变化范围是 0． 004 ～ 0．
014。其中中国四川地区的苦荞材料与其他地区来
源的组间遗传距离在 0． 010 ～ 0． 014 之间，这说明中
国四川地区的苦荞材料与其他材料的 PAL 序列差
异较大，材料具有更加丰富的变异，具有特殊性。
2． 3 PAL 基因序列的单核苷酸多态性分析
经过 DnaSP、ClustalX 1． 83 等软件的分析可知，
在 67 份苦荞材料总长为 2011 bp 的序列中，发现 46
个 SNP，无 Indel。突变频率为 1SNP /43． 7 bp。在
PAL 基因单核苷酸变异中，发生碱基转换为 23 个，
A ←→G 为 11 个，C ←→T 为 12 个，; 碱基颠换是 23 个，
分别为 A ←→T 为 6 个，A ←→C 为 8 个，G ←→T 为 5 个，
C ←→G 为 4 个。46 个 SNPs 中，转化与颠换的比率
为 1 ∶ 1。其中在 14 号苦荞材料出现的 SNP 有 10
个。在苦荞的 46 个 SNP 中，有 9 个发生在内含子
区域内，占总数的 19． 6%，而 37 个发生在外显子的
区域内，占总数的 80． 4%，编码序列的单核苷酸多
态性远大于非编码序列。
2． 4 PAL 基因的系统发育树分析
利用 PAL 序列数据构建的系统进化树如图 3
所示。从图中可以看出，参试的 67 份材料被分为 7
组。第Ⅰ类群中包含多个省份的 28 份苦荞材料，这
说明多数地区的苦荞材料 PAL 基因的差异较小，这
个类群的亚类中可明显看出同一地区的材料有明显
的地域聚类的特点。如编号为 25、28、29、32 的中国
甘肃材料等，以及编号为 49、51、56 的中国云南材料
等，说明甘肃、云南省份内的多数苦荞材料间的差异
较小。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ类群均由较少的来源于不
同省份的材料聚集在一起形成，且组成较为分散，没
有明显的地域聚类特点。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ类群中均
有中国云南地区的品种资源，这说明云南地区的材
料既有遗传分化的现象，也存在遗传相似性。第Ⅶ
类群由编号为 8、9、10、13 和 14 的 5 份中国西藏材
料组成，表明这 5 份西藏材料与其他材料遗传序列
差异较大，因此单独聚为一类群。
3 讨论
遗传多样性是生物在长期进化和发展过程中形
成的自然属性，其不仅体现在种群间和种群内，也体
现在不同个体间，是种群和个体遗传变异的总和，是
生物进化和物种分化的基础［12-13］。前人研究可知， 图 3 利用 MEGA 6． 0 构建的基于 PAL 序列的 67 份
核苷酸多样性( π) 是个体间给定位点序列的平均多 苦荞系统进化树
样性，表明一个基因的遗传变异程度［14］。苦荞 PAL Fig． 3 Phylogenetic tree of 67 tartary buckwheat
基因序列的核苷酸多样性( π) 为 0． 0034，高于苦荞 based on PAL sequence by MEGA 6． 0
536 植 物 遗 传 资 源 学 报 18 卷
CHI 基因的核苷酸多样性 ( π = 0． 0017 ) ［15］。平均 的研究主要集中于研究苦荞种质资源农艺性状的遗
杂合度( θ) 值为 0． 0143，但低于虎杖转录组基因中 传多样性及通过 SSＲ 标记的方法进行遗传多样性
的平均杂合度( θ = 0． 02519) ［16］。这表明核苷酸多 的鉴定。例如莫日更朝格图［27］对来自藏陕云贵川
样性的变异范围，随作物种类和基因类型的不同 五省区的苦荞种植资源进行了生育期、株高、主茎分
而异。 枝数等 20 个农艺性状的因子及聚类分析; 赵丽娟
3． 1 PAL 基因的苦荞遗传多样性 等［21］采用 ISSＲ 对 66 份苦养种质资源进行了遗传
苦荞具有悠久的栽培历史，作为小宗作物之一， 多样性分析，揭示了我国不同地区苦养资源的多样
在中国分布极其广泛，与中国西南边境毗邻的尼泊 性和丰富度。本试验的研究主要是通过分析苦荞的
尔也有零星种植。因此研究探讨中国苦荞与国外苦 PAL 基因的遗传信息，并对苦荞资源的遗传多样性
荞的遗传多样性水平，对于研究苦荞的起源、演化及 进行分析，为研究苦荞资源的遗传多样性提供全面
传播也具有重要的意义。 多样的认识。遗传距离等结果表明种内的遗传差异
从供试的 67 份材料的遗传多样性看，本研究结 随苦荞来源的不同而不同，表明苦荞地区资源具有
果显示，依据遗传距离及分析核苷酸多样性，均发现 丰富的遗传多样性。这与屈洋［28］利用表型性状与
四川地区的苦荞存在丰富的遗传多样性，这与赵佐 分子标记的方法研究得到的结果一致。
成等［17］利用等位酶电泳技术得到的结果相一致，这 从苦荞 PAL 基因的系统进化树中看出，67 份苦
可能与四川地区作为苦荞起源地［18-19］具有一定的 荞材料被分为 7 个类群，这些聚类结果显示多数的
关联性。湖北、西藏等地的苦荞材料也具有较丰富 苦荞材料 PAL 序列之间差异较小，分类与地理来源
的遗传多样性，这与韩瑞霞等［20］和赵丽娟等［21］所 没有关系，可能原因是苦荞 PAL 相关性状不属于选
得到的结果相一致。苦荞 PAL 基因形成丰富的遗 择和改良性状，地理位置上的隔离对 PAL 基因的影
传多样性，这些与苦荞所在的栽培环境和自然选择 响较小。但在第Ⅰ类群相同地区的苦荞资源的 PAL
有关。 基因具有一定的相似性，亲缘关系较近。而对于其
迄今为止，生物的单核苷酸多态性是植物基因 他类群中少数不同省份来源的材料聚为一类，如Ⅱ
组中 发 现 的 最 丰 富、遗 传 变 异 最 高 的 遗 传 多 态 类群中的中国四川、云南及甘肃、广西、青海的材料
性［22］。研究表明，在植物的 PAL 基因中均存在较为 聚为一类，虽然地理来源有所差异，但相似的适生环
丰富的单核苷酸多态性。在玉米基因组中每 57 bp 境、遗传漂变或基因流［29］，也可能改变了原有遗传
就有一个 SNP［23］; 而刘佳［24］在研究美洲南瓜种皮 物质组成，进而聚集为同一类群。对于独立分类群
PAL 基因时，其获得到的 815 bp 的核苷酸序列上有 的 5 份中国西藏苦荞材料，比对结果发现其材料中
25 个 核 苷 酸 位 点 发 生 变 化，变 化 频 率 为 1SNP / 具有较多的碱基转换与碱基颠换的情况。将这 5 份
32. 6 bp; 供试的 67 份苦荞材料中，发现长 2011 bp 材料与其余来源材料相比，在内含子区域内，仅上述
的 PAL 基因存在 46 个 SNPs，单核苷酸多态性频率 材料第 + 281 位处发生碱基的颠换( G→C) ，其中编
是 1 /43. 7 bp，其中编码序列的单核苷酸多态性远大 号 14 的材料发生 7 次碱基颠换、3 次碱基转换; 编
于非编码序列。出现这种现象的原因可能是由于没 号 13 的材料发生 4 次碱基转换和 3 次碱基颠换; 编
有克隆分析该基因的 5'和 3'非编码区所造成的，也 号为 10 的材料发生 2 次碱基颠换和 2 次碱基转换，
可能是某一材料中的基因编码区本身就存在较高的 材料 8 和 9 分别发生 2 次碱基颠换。可能是碱基插
突变率。SNPs 的转换 /颠换比例 ( Ti /Tv) 与物种的 入与颠换对整个序列产生影响，导致这 5 份材料
遗传多样性成反比［25］。欧阳蒲月［16］ 得到虎杖的 PAL 序列发生变化，与其他材料遗传序列差异较大，
Ti /Tv 为 1． 64，其具有中等遗传多样性水平的结论， 单独聚为一类。这 5 份材料中序列的变化原因可能
苦荞 PAL 基因的 Ti /Tv 为 1． 0，表明苦荞 PAL 基因 与自然环境，所在的气候区有关，其真实原因还需借
的遗传多样性更加丰富。 助细胞生物学及分子生物学等技术手段对其进行深
3． 2 苦荞 PAL 基因的系统进化 入研究。
通过了解自然环境下单个基因的分子变异情 在编号 14 的材料中出现的 SNP 为 10 个，这些
况，可为研究有关植物进化与变异提供方法。如涂 可能是苦荞 PAL 基因序列中存在的稀有 SNP，预示
礼莉等［26］通过克隆和测序，分析了海岛棉 NBS 类 着该基因新的突变方向［14］。陈吉宝等［14］报道在小
型抗病基因类似物的起源、多样性及进化。近几年 麦的 TaDＲEB1 编码区中存在 2 个突变热点区，PAL
3 期 李 敏等: 基于 PAL 基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析 537
编码区出现较高的 SNP 突变频率，可能是 PAL 基因 ［12］ 中国科学院生物多样性委员会． 生物多样性研究的原理与方
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的活跃，正在分化形成具有新功能的基因，使得基因 ［13］ 施立明． 遗传多样性及其保存［J］． 生物科学信息，1990，2( 4) :
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综上，67 份苦荞材料的 PAL 基因分子水平上存 ［15］ 韩瑞霞． 苦荞种质遗传多样性与 CHI 基因多样性研究［D］．
太原: 山西大学，2012
在较高的核苷酸多样性，其中四川材料存在更丰富 ［16］ 欧阳蒲月． 基于高通量测序技术的虎杖 EST-SSＲs 和 EST-
的遗传多样性。本试验为进一步开展苦荞 PAL 基 SNPs 的 开 发 及 特 征 分 析 ［J］． 中 药 材，2015，38 ( 6 ) :
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因分子标记开发和苦荞高芦丁含量育种研究奠定了 ［17］ 赵佐成，周明德，罗定泽，等． 四川省凉山彝族自治州南部三
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